酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素.pdfVIP

酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素 一、实验 目的 了解ELISA 的基本原理，及其优缺点； 掌握间接 ELISA 法的试验操作过程。 二、实验原理 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA ）是免疫酶 技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素 B1 （Aflatoxin B1 ，AFB1 ）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液） 及黄曲霉毒素 B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素 B1 与黄曲霉 毒素 B1 酶标记物竞争黄曲霉毒素 B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被 除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色 的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在450nm 处测量，吸收光强度与 样品中黄曲霉毒素 B1 的浓度呈负相关。 三、实验器材 1、ELISA 试剂盒 其组成如下： 1.1 包被抗体的反应板 48 孔 1.2 A 试剂：样品稀释液 l 瓶 1.3 B 试剂：AFB1 标准溶液 l 套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL) 1.4 C 试剂：酶标抗原 l 瓶 1.5 D 试剂：酶标抗原稀释液 l 瓶 1.6 E 试剂：浓缩洗涤液 l 瓶 1.7 F 试剂：显色底物液 a l 瓶 1.8 G 试剂：显色底物液 b l 瓶 1.9 H 试剂：终止液 l 瓶 1.10 反应板框架 l 块 2、仪器 1.1 酶标仪(内置450nm 滤光片) 1.2 50µL 微量移液器及配套吸头 1.3 恒温培养箱 (0℃-50℃) 1.4 冰箱 (4 ℃-8℃) 1.5 感量 0.0lg 的天平 1.6 调速振荡器或超声波清洗器 1.7 离心机 5000r/min 1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移 液管等 1.8 小型粉碎机或碾钵 1.9 其它：滤纸，吸水纸等 四、实验步骤 1、实验准备 1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列 “样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标 准及样品稀释表” 1.1.1 脂肪含量小的固体样品 (如大米、玉米、小米等) 称取 5.0g 样品 (已粉碎)于 100mL 具塞三角瓶中，准确加入 25.00mL 甲醇水(1+1) 溶液，于振荡器上剧烈震荡 15min，过滤，弃去 l/4 初滤液，收集试样滤液，此液为样 品提取液。根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂 (样品稀释液)将样品提取液进行适 当稀释 （如100µL 样品提取液+ 100µL 样品稀释液，总稀释 10 倍），即为待测样液。 1.1.2 花生 样品去皮粉碎 (刀切或剪切)，称取 5.0g 于 100mL 具塞三角瓶中。加入 25.0mL 甲 醇水(1+1)溶液和 20mL 正已烷(或石油醚)，于振荡器上剧烈震荡 l0min，过滤于分液漏 斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，根据样品的国家允许 量标准，用 A 试剂 (样品稀释液)将提取液进行适当稀释 （如100µL 样品提取液+300µL 样品稀释液，总稀释 20 倍），即为待测样液。 1.1.3 一般饲料及原料 称取 5.0g 样品于 100mL 具塞三角瓶中，准确加入 25.0mL 甲醇水(1+1)溶液，于振 荡器上剧烈震荡 15min，过滤，弃去 1/4 初滤液后收集滤液，此液为样品提取液。根据 样品的国家允许量标准，用 A 试剂 (样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100µL 样品提取液+900µL 样品稀释液，总稀释 50 倍），即为待测样液。 1.2 试剂的配制 1.2.1 每瓶 C 试剂 （酶标抗原）中准确加入 1.5mL D 试剂 (酶标抗原稀释液)，充分溶解， 配成实验用酶标抗原溶液，