外源性DNA残留量测定法(qPCR法).docVIP

重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体 外源性DNA残留量测定法(qPCR法) 1原理 实时定量PCR（qPCR）扩增分2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长速度变慢，反应进入平台期。 反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环数，即CT。CT值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物，产生高过背景的荧光信号，因此，反应就有一个小或早出现的CT；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的CT。两者之间关系的建立是qPCR用于定量的依据。 2主要仪器 表2 仪器信息表 名 称 厂 家 型 号 实时定量PCR仪 Bio-Rad CFX Connect 3主要试剂 表3 试剂信息表 名 称 厂 家 规 格 残留DNA样品制备试剂盒 ABI Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle; Binding Solution,1 empty bottle; Wash Buffer Concentrate, 2 bottles, 26 ml/bottle; Elution Buffer; 1 bottle, 25ml; Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml; Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube; Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml; Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml,0.5ml; Glycogen, 2 tubes,5mg/ml,1.0ml/tube. 残留DNA定量检测试剂盒（CHO） ABI DNA Control,1 bottle,40μl; DNA Dilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml; 2×Environmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube; 10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300μl; 5) Negative Control, 1 tube,1.0ml. 4溶液配制 4.1 蛋白酶K混合液（新配） 附件13-14 附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法（qPCR） 1 reaction （100μl/sample） 10 reaction （100μl/sample） Proteinase K 10μl 100μl Proteinase K Buffer 60μl 600μl 4.2 裂解混合液（新配） 试 剂 体 积（μl） Glycogen（5mg/ml） 180 tRNA（10mg/ml） 4 Lysis Buffer 7600 合 计 7784 4.3 DNA标准品稀释 Tube label Dilution pg/μl pg/ reaction DNA Control 30000 300000 SD1 10μl DNA Control+990μl DDB 300 3000 SD2 50μl SD1+450μl DDB 30 300 SD3 50μl SD2+450μl DDB 3 30 SD4 50μl SD3+450μl DDB 0.3 3 SD5 50μl SD4+450μl DDB 0.03 0.3 SD6 50μl SD5+450μl DDB 0.003 0.03 NTC DDB 0 0 注：DNA标准品溶液4℃放置保存1天，-20 5测定方法 5.1样品处理 5.1.1 1）在2ml离心管中加入100μl样品； 每100μl的样品中加入70μl的蛋白酶K混合液，混合均匀，56℃ 每100μl的样品中加入360μl的裂解液，室温裂解2小时以上。 5.1.2 1）磁珠使用前于37℃ 2）每100μl的样品加入30μl的磁珠悬浮液； 3）每100μl的样品加入300μl的Binding Solution，涡旋混合5min； 4）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置5min直至溶液清澈，弃上清； 5）从磁力架上取下离心管，加入300μl的Wash Buffer，涡旋混合5 sec； 6）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，弃上清； 7）重复步骤6）