七质粒DNA的提取和鉴定.ppt

实 验 七 质粒DNA的提取和鉴定 目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解质粒酶切鉴定原理 提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　脂类及小分子杂质 　RNA 质粒DNA的提取方法 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需) 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求 碱裂解法 基本原理： 1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来 2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是开环结构。 为什么提取的质粒有三条带？ 一 细菌培养与质粒扩增 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37℃过夜培养。 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37℃振荡过夜培养。 从中取4毫升种子菌液于LB培养基中（含Ap），37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）。 二 质粒提取 取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min，4℃，30sec。 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，剧烈振荡。 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。 酶切鉴定 10μL溶液 + 10×内切酶缓冲液2μL + 5～10U酶到一Eppendorf管，37 ℃，1-2h，加2μL的反应中止液。 10μL,质粒 5μL，水 1μL，Bamh1 1μL，Sal1 3ul, Buffer T 供20μL 电泳： 1. 1％Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照 思考题 染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？ 参考答案 注意 EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去 * * 质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。 转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。 3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。 加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。 加入等体积酚/氯仿（约450ul)，剧烈震荡， 12000r/min，离心5min 将上清夜转至另一Eppendorf管中，向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，-20度放置10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。 50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20℃保存） 纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象 *