生化 实验技术专题.pdfVIP

生化实验技术专题 主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一 般步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离 心技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋 白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。 第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几类主要的生化实验技术 第三节 蛋白质、核酸的检测 第一节 生物大分子物质的制备 一．一般过程和原则 •确立有效成分的测定方法 •材料的选择和预处理 •细胞的破碎和细胞组分分离 二．注意事项 •有效成分的抽提 •有效成分的纯化和浓缩 三．纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 层析法 电泳法 生物组织→ →提取液→ →粗产品→ →结晶 超离心法 透析和超滤 │←前处理→ │ ←粗分级→ │ ← 细分级 → │ 依据原理 •分子大小 •材料选择与处理 •盐析 （硫酸铵盐析） •溶解度 •细胞破碎 （机械破 •等点电沉淀 • 电荷性质 碎、溶账和自溶、 •有机溶剂沉淀 •吸附性质 酶解、化学处理） •离心 •生物亲和力 注意事项 基本原则：防止生物分子变性、降解 1．控制适当的pH 2 ．控制低温 3 ．注意提取过程中的溶液环境 4 ．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基 宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg ） （U ） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27