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流感病毒的快速检测方法 一、 RT-PCR 快速诊断方法 （一） 生物安全要求 （二） 病毒核酸提取 （三） RT-PCR （四） PCR 产物纯化 （五） 流感病毒 RT-PCR 检测引物 二、 免疫荧光方法检测流感病毒 （一） 原理 （二） 标本处理 （三） 间接免疫荧光法 （四） 结果判断 三、 实时荧光定量 PCR （Real-Time PCR ）快速诊断检测 （一） 基本原理 （二） 实验试剂 （三） 实验步骤 四、 快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。 因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。 流感的快速诊断包括直接和间接免疫 荧光法、 ELISA 、RT-PCR 、Real-Time PCR 快速诊断速方法、流感快速诊断试 剂盒等。这里介绍 RT-PCR 、Real-Time PCR 、免疫荧光快速诊断速诊断方法和 几种流感快速诊断试剂盒优缺点。 无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离 鉴定方法。 一、 RT-PCR 快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法， 即使基因组含量很低或死 病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（ PCR ）。 流感病毒的基因组是负链 RNA ，在进行 PCR 扩增前必须合成与病毒 RNA 互补的 DNA ，即为 cDNA 。逆转录酶（ RT ）就是用于合成 cDNA 的多聚酶，因 此，扩增流感病毒基因组的过程称为 RT-PCR 。 RT-PCR 需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（ dNTPs ），RNA 模板， 逆转录酶及 Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的 RNA 逆转录合成 cDNA ，然后再进行聚合酶链反应经 25 ～30 个循环， 使 DNA 产物达到倍增的效 果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求： 生物安全二级实验室， 防护要求与二级实验 室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽 H5 RT-PCR 快 速检测时可以在生物安全二级实验室里进行， 核酸提取在生物安全三级实验室的 生物安全柜里完成。 （二）病 毒核酸提取 1. 实验材料及仪器 (1) QIAGEN 公司的 Rneasy Mini Kit （Catalog# 74104 ） (2) β-巯基乙醇（ β-mercaptoethanol ） (3) 70% 乙醇 (4) 无菌 1.5ml 离心管 (5) 10 μl、20 μl、200 μl、1000 μl加样器和枪头 (6) 可调 14K 微型离心机 (7) 旋转混合器 2. 操作步骤 (1) 取 1 支无菌、无 RNA 酶的 1.5ml Eppendorf 管，加入 500 μl RLT。 (2) 取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或 细胞培养液） 100μl，加入上述 Eppendorf 管中。 (3) 加 5 μl -巯基乙醇，充分混匀。β (4) 加 600 μl 70%乙醇，于旋转混合器混匀。 (5) 从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。 (6) 将第 4 步的混合液体分两次 （每次600 μl） 吸入于滤柱中， 12000rpm