优质实用课件精选——毛细管电泳法.pptVIP

高效毛细管电泳仪的主要组成： 高压电源；缓冲液池(样品池）；毛细管柱； 铂电极；检测器；数据处理系统，（恒温系统） 20.3 HPCE 仪器的基本结构 一般流程：预平衡、进样、分离、检测和数据处理 高效毛细管电泳仪实图 高压电源：采用（0 ? ±30）kV连续可调的直流高压电源，电压输出精度应高于0.1％。 高压电源应能够切换极性。 电极：两个相同的直径0.5 ?1mm的铂丝制成，可用注射器针套代替铂丝。 一般一端为高压电极，一端接地。 注意！高压电的安全保护问题 措施：注意保持干燥、隔离或适当降低分离电压。 一、高压电源 二、 毛细管柱 管材要求：化学和电惰性，能透过紫外和可见光，有一定的韧性，易于弯曲，耐用而且便宜。 常用管材： 聚四氟乙烯：能透过紫外光，柱均匀性差。 玻璃：电渗最强，杂质含量较高 ?石英： 柱参数： 内径： 25 ? 75?m 柱长： 70cm 管壁的厚度： 石英本身： 涂在外测的聚酰亚胺：几个 ?m 细柱子的最大优点： （1）减小电流，因此能减少自热（焦耳热）。 （2）增大散热面积（侧面积/截面积），因而能加快散热，减小径向扩散，保持电渗流型为扁平型，提高柱效。 厚壁（375 ?m ） 薄壁（150?m ） 用石英毛细管作电泳分离时，会遇到两种现象 （1）电渗： 适当控制（分离大分子蛋白） （2）吸附 ：予以消除 消除吸附方法： 毛细管壁改性是限制溶质吸附的一种有效手段 管壁静态改性：在管壁涂渍亲水聚合物可以减少电渗同时减少吸附。 管壁动态改性：改变缓冲溶液和加入添加剂 对CE进样技术的要求： 进样时不能引入显著的区带扩张，以确保系统的高效。进样区带宽度大体是柱长的1％?2％。 样品量必须100nl，否则易造成过载。 三、 CE的进样技术 直接柱头进样的进样方式 电动进样 （电迁移进样） 气动进样（压力进样） 扩散进样：浓差扩散原理 毛细管的阳极端（假设电渗流向接地端移动），先不与缓冲溶液接触，而直接置于样品溶液中，然后在很短的时间内施加进样电压（为分离时操作电压的1/5或1/3），使样品通过电迁移进入毛细管。 1.电动进样（也称电迁移进样） 通过改变进样电压和进样时间控制样品的进样量。 一定时间t进样的量Q（g或mol）可以用下列公式计算： ?ep—组分的电泳淌度 ?os—组分的电渗率 V —外加电压 r —毛细管内径 c —组分的浓度 t —进样时间 L —毛细管的总长度 特点： ?进样装置简单，不需要附加设备， 在介质粘度很高时使用更加有利。 ?是凝胶电泳进样的唯一方式。可用于痕量富集。 ?其突出的特点为实际的进样量与组分的表观淌度有关。存在“歧视效应”，即电泳淌度大的组分进样量大，反之则小。 三种办法： （a）在进样端加压 （b）在出口端减压 （c）调节进样槽和出口槽之间的相对高度使之产生虹吸现象。 2.气动进样（压差进样）:最常用的进样方法 特点：不存在“歧视效应”，进样量不受样品基质的影响，应用最广泛。 进样体积可通过Hagen-Poiseuille方程求出。 △P—毛细管两端的压力差 d—毛细管的内径 t—进样时间 η—缓冲溶液的粘度 L—毛细管的总长度 进样的重现性优于1%～2%RSD！ 进样量是通过毛细管截面的压差、样品组分的浓度、毛细管的尺寸、缓冲溶液的粘度和进样时间的函数。与样品的淌度无关。 缓冲溶液池：小玻璃瓶或聚四氟乙烯塑料瓶（1? 5ml） 带螺帽的， 要便于密封。 四、 CE 的检测器 CE对检测器的要求： 既能作灵敏检测，又不使谱带展宽。（死体积小） 一般采用柱上检测。 CE检测器方法 紫外可见光检测器? 二极管阵列检测器 ? 荧光检测器（激光诱导荧光）? 电化学检测器? 质谱检测器 ? 其他 电导检测法 安培检测法 电位检测法 1.紫外－可见检测器：最常用 除去保护层 特点： 通用性好，特别是对蛋白质的适用很强。 类型： 固定波长 可变波长 DAD A = Ecl 增加光程，提高检测灵敏度 特点： （1）多波长信号检测 （2）峰纯度的确定 （3）峰的定性确证 （4）未分离的峰的定量：峰消除或信号扣除的方法 2. 二极管阵列检测器 消色差透镜把光聚焦在毛细管上，透过光束被一个衍射光栅色散到光二极管阵列上（211个）。 可获得时间－波长－吸光值三维电泳图。 3.激光诱导荧光检测器：灵敏度最高 优点：激光光强度大，单色性、相干性好；聚焦性能好，易于校准并减小光的散射；可以使用更小孔径毛细管；灵敏度高，检测限达，可实现单细胞检测。 缺点：通用性差，适合DNA检测， 样品需要衍生化。 检测方法：把一束激光发出的辐射通过短聚焦透镜或显微物镜聚焦到毛细管壁上，通过一个棱镜系统或者（显微