精选第4章 细胞培养.pptVIP

鸡胚胎成纤维细胞的传代培养 1. 原代培养的细胞铺满瓶底时（约 2 天），即可 进行传代； 2. 吸出原培养液，然后用 PBS 清洗细胞 2~3 次，尽 量除去残余的血清； 3. 加入 0.2 mL 的消化液进行消化，消化程度可在 倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细 胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度； 鸡胚胎成纤维细胞的传代培养（续） 4. 吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培 养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消 化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞； 5. 收集细胞悬液， 1000 rpm 离心 5 min ，弃 上清； 6. 用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活力和 密度，以 5 × 10 5 个 /mL 密度（ 1 ： 3 ）接种 到培养瓶中，于 38.5 ℃、 5% CO 2 浓度、饱 和湿度条件下培养。 4.4 细胞系和细胞株的建立 细胞系和细胞株的种类 ? 原代培养 ? 细胞系 ? 克隆细胞株 ? 二倍体细胞 ? 遗传缺陷细胞 ? 肿瘤细胞系或株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞 分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形 成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步 分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称 之为亚株（ Substrain ） 细胞株 4.2.1 细胞培养的常用液体 ? 水 ? 平衡盐溶液 ? 消化液 ? 消化酶抑制剂 ? pH 调整液 ? 抗生素液 ? 谷氨酰胺补充液 血清抑制 胰蛋白酶 磷酸盐缓冲液 Phosphate buffered saline ( abbreviated PBS ) 原代培养时常常需要将组 织块消化解离形成细胞悬 液，传代培养时也需要将 贴壁细胞从瓶壁上消化下 来，常用的消化液有 胰酶 （ Trypsin ）溶液和 EDTA 溶液，有时也用胶原酶 （ collagenase ）溶液等 。 PBS: Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 ? PBS is a solution commonly used in biological research. ? PBS has many uses because it is isotonic and non-toxic to cells. It can be used to dilute substances. 4.2.2 培养基 细胞培养基的基本要求 ? 体外培养的细胞直接生活在培养基中， 因此培养基应能满足细胞对营养成分、 促生长因子、激素、渗透压、 pH 等诸多 方面的要求。 无毒、无污染 ? 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵 抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生 物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他 对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、 补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程 及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合 成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水， 器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌 。 2 天然培养基 ? 天然培养基是指来自动物体液或利用组织 分离提取的一类培养基，如血浆、血清、 淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建 立早期，体外培养细胞都是利用天然培养 基。但是由于天然培养基制作过程复杂、 批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替 代。目前广泛使用的天然培养基是 血清 。 血清 (serum) ? 血清种类 : 主要是牛血清，培养某些特殊细胞也 用人血清、马血清等。 ? 牛血清分为小牛血清 (calf serum ， CS) 、胎牛 血清 (fetal bovine serum ， FBS) 。胎牛血清应 取自剖腹产的胎牛；新生小牛血清取自出生 24 小时之内的新生牛；小牛血清取自出生 10-30 天 的小牛。 为什么主要是牛血清？ fetal bovine serum ， FBS ? When the media is needed, add 50-ml of FBS and 5-ml of antibiotics to one of the portions. This completes the media for use. ? I need to decrease the concentration of FBS in my media. Normally, I use 10% FBS and I