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淋巴细胞的分离技术与培养 1 细胞分离原理与手段 ? 基于对细胞物理特性 1 细胞比重差异（自然沉降法、密度梯度离心法、 改变细胞密度法） 2 细胞的粘附性（贴壁细胞对玻璃、塑料器皿的粘 附， B 细胞对尼龙棉的粘附） 3 细胞对渗透压改变的敏感性（红细胞对低渗敏感 ，低渗处理，能使其裂解） ? 基于细胞表面的特异性标志物 1 补体细胞毒分离法 2 免疫磁珠分离法 3 流式细胞术 2 血液细胞的组成及比重 外周血 红细胞 粒细胞 单个核细胞 血小板 淋巴细胞 单核细胞 1.093 1.030~1.035 1.075~1.090 (PBMC) 1.092 3 单个核细胞的特点 ? 单核细胞：贴壁生长，能吞噬羟基铁粉 ? 淋巴细胞：悬浮生长 1 粘附力： B 细胞——尼龙棉 2 细胞表面标志物 T 细胞： CD2 、 CD3 、 CD4 、 CD8 、 CD25 等 NK 细胞： CD2 、 CD8 、 CD16 、 CD56 等 4 淋 巴 细 胞 分 离 的 流 程 密度梯度 离心法 粘附去除 改变细胞密 度法 E 花环分离法 尼龙棉分离法 流式细胞术 磁珠分离法 5 单个核细胞的分离 — 密度梯度离心法 6 原理： 外周血各种 血细胞的比重不同 ，利用淋巴细胞分 层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯 度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于 1.075 ～ 1.092 之间而近于 等 渗 的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞 按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有 Ficoll 和 Percoll 两种。 密度梯度离心法 7 ? Ficoll ： 1.077 ± 0.001 ? Percoll 常用密度 20% 1.031 30% 1.043 40% 1.056 50% 1.067 60% 1.077 70% 1.090 细胞 比重 血小板 1.030~1.035 单个核细胞 1.075~1.090 粒细胞 1.092 红细胞 1.093 细胞比重 分层液比重 8 离心后 PBMC 红细胞 粒细胞 Ficoll/60% Percoll 稀 释 外 周 血 稀释 的血浆 、血小板 Ficoll/60% Percoll 9 实验步骤 1. 采血，稀释 （ 外周血：稀释液 =1 ： 2 ） 2. 在离心管中加入分层液，沿倾斜的管壁缓缓加 入稀释的外周血 （ Ficoll ：稀释血 =1 ： 2 ） 10 3. 20℃， 1500r/min ，离心 30min 4. 沿管壁周缘轻轻吸取 PBMC 层移入另一试管中 5. 加足量稀释液 充分洗涤， 1800 r/min 离心 10min ，弃 上清 6. 重复洗涤一次， 1400r/min 离心 10min ，弃上清 7. 适量的培养基重悬细胞 ，计数 8. 细胞活性检测 11 淋巴细胞分离 — 吸附法和改变细胞密度法 单核细胞：贴壁生长，能吞噬羟基铁粉 淋巴细胞不具有这些特点 12 粘附去除法 原理： 单核细胞和粒细胞在37℃和 Ca 离子存在条件下能主 动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。 采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 方法： 1 、玻璃器皿吸附法 2 玻璃纤维柱法 优点： 简便易行，对细胞损伤极少。 缺点： B 细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分 B 细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约 95% 的单个核细胞为淋巴细 胞，活性大于 95% 。 13 改变细胞密度法 原理： 单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基 铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一：磁铁吸引法 方法二：羟基铁 - 乳胶分层液法 14 T 、 B 、 NK 细胞的分离 T 细胞能与 STBC 结合形成 E 花环 —— E 花环分离 T 细胞 B 细胞对尼龙纤维特有的吸附能力 —— 尼龙纤维分离 B 细胞 淋巴细胞表面的标志差异 —— 免疫磁珠分离法与流式细胞术 15 E 花环分离法 原理： 人类 T 细胞表面上有能 与绵羊红细胞相结合的受 体（ E 受体， CD2 ） , 能与 经 2- 氨乙基异硫溴化物（ AET ）处理的绵羊红细胞 结合，形成稳定的、细胞 体积和比重较大的 E 花环 。 16 实验步骤 1 AET-E 花环实验 ：将分离的单个核细胞（ 20 万 /ml) 与等量的 1?T-SRBC 混合， 37 ℃水浴 15min, 每 5min 摇匀一次，然后分装，每管 2~3ml ，低速离心 （ 1000r/min)5min 后， 4 ℃冰箱 45 分钟。 2 T 、 B 细胞分离： 淋巴细胞 +SRBC 悬液→加入分层液→ T 细胞形成 E 花 环而沉于管底→悬液