琼脂糖凝胶电泳检测dna 课件.ppt

琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 丁新伦 dingxinlun163 【一】 背景知识 凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段最常用的技术； 分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。 根据制备凝胶的材料 : 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳 【二】实验目的 ? 学习琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理和方法 ? 检测碱裂解法提取质粒的结果 ? 检测双酶切法鉴定重组质粒的结果 ? 检测 PCR 法鉴定重组质粒的结果 【三】实验原理 （ 1 ）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳 的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。 DNA 分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧 密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可 以分离大小不同的 DNA 或 RNA 分子。 （ 2 ）琼脂糖是一种 线性多糖聚合物 ，可以形成具有刚 性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度 (%) 线型 DNA 分子的分离范围 (Kb) 0.3 5 ～ 60 0.6 1 ～ 20 0.7 0.8 ～ 10 0.9 0.5 ～ 7 1.2 0.9 ～ 6 1.5 0.2 ～ 3 12.0 0.1 ～ 2 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA 分子大小来确定。 （ 3 ）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射 下发射荧光。 EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复 合物，其荧光强度与 DNA 的含量成正比。据 此可判断 DNA 分子量大小和粗略估计样品 DNA 浓度。 ? 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 ? 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度 (%) 线型 DNA 分子的分离范围 (Kb) 0.3 5 ～ 60 0.6 1 ～ 20 0.7 0.8 ～ 10 0.9 0.5 ～ 7 1.2 0.9 ～ 6 1.5 0.2 ～ 3 12.0 0.1 ～ 2 【四】仪器、材料与试剂 ? 质粒样品、酶切样品和 PCR 样品。 ? 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统 ( 凝胶成 像系统 ) 等。 ? 琼脂糖、 1X TBE 电泳缓冲液 、 溴化乙锭 、 6X 载样缓冲液 （ 6X loading buffer ）和 DNA 分子量标准（ Lambda DNA / Eco RI + Hin dIII Marker ）等。 凝胶电泳系统 DYY-6C 型 双稳定时电泳仪电源（北京六一） 输出范围（显示分辨率）： 6-600V(1V) 4- 400mA (1mA) 240W 美国 Bio-rad 伯乐 小型水平电泳槽 Mini-Sub Cell GT Cell 凝胶成像分析系统 Lambda DNA / Eco RI + Hin dIII Marker （ Ferments ） 一个已知分子质量的 DNA 样品做最对照， 用来确定待测样品的 相对分子质量。 常用电泳缓冲液 缓冲液 缓冲容量 迁移速度 分辨率 用途 TAE 最低 最快 ( 高 10 ％ ) 高分子量 高 高度复杂 DNA 混合 物；超螺 旋 DNA TBE 很高 较慢 低分子量 高 价格昂 贵，不 常用 TPE 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一 般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400 组成上样缓冲液。 作用： ①增加样品比重，以确保 DNA 均匀沉入加样孔 内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速 度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 上样缓冲液 溴化乙锭 ? 溴化乙锭（ 3 ， 8- 二氨基 -5- 乙基 -6- 苯基菲啶溴 盐 Ethidium Bromide ， EB ）， EB 染色（ EB 可很 好地掺入到双链 DNA 中），在紫外光下会发出橙 红色的荧光，用于对 DNA 进行染色和观察。 用于观察的紫外光有３种波长，一般使用中波紫外 光（３０２ｎｍ）。 短波紫外光（２５４ｎｍ）观察效果较好，但对 DNA 的破环很大。 长波紫外光（３６６ｎｍ）：回收。 ? EB 染料优点：染色操作简便，快速，室温 下 15-20min ；不会使核酸断裂；灵敏度高， 10