北大现代分子生物学蛋白质工程概论1教学案例.ppt

总之，蛋白质结构和动力学研究是蛋白质结构与功能关系研究的重要手段，而改造蛋白质结构，则依靠基因工程，基因工程的发展从技术上提供了改变蛋白质个别氨基酸残基或肽段的手段，使结构改变已能在实验室实施，二者结合则产生了蛋白质工程。 三、蛋白质工程的研究内容 （一）利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用研究 （二）定量蛋白质结构与功能关系的研究 （三）根据已知结构-功能的关系人工改造蛋白质 （一）利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用研究 蛋白质的结构决定蛋白质的功能和理化性质，而蛋白质功能区的某个或某些氨基酸残基可能在维持蛋白质的结构、功能、理化性质中起重要作用。 因此，定点改变这些氨基酸序列，即可能改变蛋白质的功能和特性，使之更适合于工业化生产的要求。 如前所述枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的Ser221邻近的Met222易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。 （二）定量研究蛋白质结构与功能的关系 这是目前蛋白质工程研究的主体。这一类研究的课题很广泛，包括蛋白质三维结构模型的建立，配体结合和酶催化的性质，蛋白质折叠和稳定性研究，蛋白质变异等等。这类研究看起来偏重理论，但对于指导实际工程意义重大。 （三）根据已知结构-功能关系人工改造蛋白质 蛋白质工程是研究蛋白质结构和定点改造蛋白质结构的一门学科，其创造性成就在于开创了按照人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的新时期。根据蛋白质结构和功能的关系，采用基因定点诱变技术，人工改造蛋白质则是蛋白质工程的主要研究内容之一。其主要研究内容如下： 通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效及独立工作的能力 用定点诱变技术不仅可以提高蛋白质的稳定性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底物的亲和程度，并利用定点诱变技术对蛋白质进行改造，提高酶的活性。 表4－4 天然和诱变酪氨酰-tRNA合成酶活性 酶 Kcat(s-1) Km(mmol/L) Kcat/Km(s-1mol-1) Thr-51 4.7 2.5 1.860 Ala-51 4.0 1.2 3.200 Pro-51 1.8 0.019 95.800 通过改变蛋白质的结构顺序，提高其在极端条件（如酸、碱、热等）下的稳定性；例如: 蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（－SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（－Ｓ－Ｓ－）。 二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。 在一项研究中，通过寡核苷酸定点诱变构建了T4溶菌酶的六种变异体,比较了它们的活性. 表4－1 T4溶菌酶和6种设计的变体特性 酶 氨基酸的位置 二硫键的数目 相对活性 Tm 3 9 21 54 97 142 164 (%) (℃) wtα Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9 pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9 A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7 B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3 C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9 D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6 E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9 F Cys Cy