EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达与检测.pptVIP

第几章 扩增菌株提取质粒 EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 EGFP 基因和 pET28a 载体的双酶切 pET28a-EGFP 重组表达载体的构建 EGFP 基因的原核表达与检测 SDS凝胶电泳分离蛋白质 ( 含 pEGFP-N3 和 pET-28a 的大肠杆菌 DH5 α ) （ 1 ）固 - 液接种：从 LB 平板上挑取含有以上质粒的 E. coli DH5 α 单菌落，接种于 5mL LB 培养基中， 37 ℃振荡培养过 夜。 （ 2 ）液 - 液转接：以 1% 接种量将过夜培养的 E. coli DH5 α 接 种于新鲜 LB 培养基中， 37 ℃， 220 rpm 振荡培养 2 ～ 2.5h 。 三 1- 扩增菌株及提取质粒 1.1 扩增菌株 （ 1 ）取 1.0 ～ 5.0 mL 的菌液，室温下 13000 rpm 离心 1 min 收集细菌。 （ 2 ）倒弃培养基，加入 250 μ L Solution Ⅰ /RNase A 混合液，涡旋振荡使细胞完 全悬浮。 （ 3 ）往重悬混合液中加入 250 μ L Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀 4 ～ 6 次，此操作 避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过 5 min 。 （ 4 ）加入 250 μ L Solution Ⅲ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。 （ 5 ）室温下， 13000 rpm 离心 10 min 。 （ 6 ）转移上清液至套有 2 mL 收集管的 HiBind DNA 结合柱中，室温下， 13000 rpm 离心 1 min ，倒去收集管中的滤液。 （ 7 ）把柱子重新装回收集管，加入 500 μ L HB Buffer ，按上述条件离心，弃去 滤液。 （ 8 ）把柱子重新装回收集管，加入 700 μ L DNA Wash Buffer ，按上述条件离心， 弃去滤液（注意：浓缩的 DNA Wash Buffer 在使用之前必须按标签的提示用无 水乙醇稀释）。 （ 9 ）弃去滤液，把柱子重新装回收集管， 13000 rpm 离心空柱 2 min 以甩干柱 子基质（注意：不要忽略此步 —— 这对去除柱子中残留的乙醇至关重要）。 （ 10 ）把柱子装在干净的 1.5 mL 离心管上，加入 50 μ L Elution Buffer 到柱子基质 中，静置 1 ～ 2min ， 13000 rpm 离心 1 min ，洗脱出 DNA 。 三 1- 扩增菌株及提取质粒 1.2 提取质粒（ pEGFP-N3 、 pET28a ） 三 2- EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 2.1 EGFP 基因的 PCR 扩增 三 2- EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 2.1 EGFP 基因的 PCR 扩增 三 2- EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 2.1 EGFP 基因的 PCR 扩增 三 2- EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 2.1 EGFP 基因的 PCR 扩增 三 2- EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 2.1 EGFP 基因的 PCR 扩增 E coR Ⅰ （ 192 ） H ind Ⅲ （ 173 ） 三 2- EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 2.1 EGFP 基因的 PCR 扩增 三 2- EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 2.1 EGFP 基因的 PCR 扩增 以 pEGFP-N3 中的 EGFP 片段作为 PCR 反应的模板，设计引 入 Eco R I 酶切位点的上游引物 ( 5 -GGA ／ GAATTC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3 ) 和引入 Hind Ⅲ酶切位点的下游引物 ( 5 一 CCG ／ AAGCTT GGCTGATTATGATCTAGAGTC- 3) 三 2- EGFP 基因的 PCR 扩增和回收 2.1 EGFP 基因的 PCR 扩增 产物 5— GGA GAATTC ATG GTG ———— TCA GCC AAGCTT CGG —3 3— CCT CTTAAG TAC CAC ———— AGT CGG TTCGAA GCC —5 三 3- EGFP 基因和 pET28a 载体的双酶切 3.1 酶切位点分析 选择重组酶切位点的 3 个原则： 1. 读码框正确 2. 不能破坏载体或目的片段 3. 两个酶缓