利用CRISPRCas9基因编辑技术定向改良水稻稻瘟病抗性.pptVIP

利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术定向改 良水稻稻瘟病抗性 水稻作为世界上食用人口最多的农作物 , 其产量每年都会因稻瘟 病的流行而减产。目前 , 控制稻瘟病爆发的有效策略就是使用抗 性品种。 近年来 ,CRISPR/Cas9 基因编辑技术的诞生解决了传统育种过程 中育种年限及连锁累赘等问题 , 为作物遗传改良提供了新的育种 平台。本研究利用 CRISPR/Cas9 系统对水稻 Pita,Pi21 和 ERF922 稻瘟病相关基因进行定点编辑 , 以期获得能够稳定遗传的抗抗稻 瘟病水稻材料。 本研究主要结果如下 :1.Pi21 基因是在隐性状态下发挥对稻瘟病 菌的抗性 , 而 ERF922 则负调控稻瘟病菌的抗性 ,Pita 对稻瘟病的 抗感差异是由于第 918 位氨基酸位点的变化而引起。我们选择 3 个基因的第一外显子靠近 ATG 附近的序列作为靶序列构建共编辑 载体 pC1300-2 × 35S::Cas9-gsupPita/sup- gsupPi21/sup-gsupERF922/sup, 用农杆菌转化长粒粳 稻恢复系 L1014 。 在 Tsub0/sub 代转基因阳性株中 ,Pita,Pi21 和 ERF922 三个基 因发生突变的频率分别为 75%,85% 和 75%,Pita 发生突变的基因型 多为双等位突变（ 47.1% ） , 其次 , 纯合基因型的频率为 41.2%, 无 杂合基因型的出现 , 但有 2 株阳性苗在 Pita 靶点处未发生突变 （ 11.7% ） , 在基因突变类型中有 73.5% 是碱基的插入 ,14.7% 为碱 基的缺失 , 有 11.8% 的频率是碱基未发生改变 ;Pi21 突变基因型的 情况与 Pita 类似 , 双等位突变频率为 58.8%, 其次纯合基因型频率 为 35.3%, 而杂合基因型频率为 5.9%, 但基因突变类型以碱基缺失 为主 , 频率高达 85.3%, 另外 , 有 8.8% 、 2.9% 和 2.9% 分别为碱基插 入、替换和无突变的类型 ;ERF922 的突变类型较为丰富 , 包括碱 基的插入、缺失、替换及替换缺失同时发生这四种类型 , 其中碱 通过对 Tsub1/sub 代分离群体的筛选 , 得到了 2 种 Pi21 单基因 突变和 1 种 Pita Pi21 和 ERF922 三基因突变不含 T-DNA 成分的纯合 突变株系 , 并以此分别构建 3 个 Tsub2/sub 代纯合突变系群体 （ D2101 、 D2102 和 D0301 ）。 2. 对三种纯合突变株系的苗期进行 稻瘟菌接种鉴定 , 并在接种后 0 h 、 12 h 、 24 h 分别取样。 结果表明 , 纯合突变株系的抗性相比于野生有显著的提高。对接 种后的纯合株系和野生型的防卫相关基因的表达量进行分析 , 相 较于野生型 , 突变株系增强了水杨酸 , 茉莉酸和乙烯的信号转导 途径相关基因的表达 , 因此 , 我们推测这些防御相关基因的高表 达增强了突变株系对稻瘟病的抗性。 同时对纯合突变株系的主要农艺性状进行考察 , 其株高、剑叶长、 剑叶宽、穗长、有效穗数、每穗粒数、结实率及千粒重与野生 型无明显的差异。利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和 具有一定稻瘟病抗性的纯合突变株系 , 为水稻稻瘟病抗性改良提 供了良好的材料。