组织DNA与RNA的分离和提取.docVIP

组织DNA与RNA的分离和提取 一、实验材料 1.器材 手术器械、匀浆器、台式微量高速离心机、微量加样器、振荡器、水浴锅。 2.试剂 （1）0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA：称NaCl 8.18g、乙二胺四乙酸二钠盐3.72g，加蒸馏水溶解，调pH至7，稀释至1000ml，贮放冰箱中；（2）25% SDS：称取十二烷基硫酸钠25g，溶于50%的乙醇中至100ml，室温存放；（3）2mol/L NaCl：称11.7g NaCl，用蒸馏水配置成100ml溶液；（4）氯仿-异戊醇：氯仿24份与异丙醇1份混匀；（5）80%酚：取苯酚80份，加蒸馏水20份，混匀后装棕色瓶中；（6）0.05mol/L醋酸缓冲溶液（pH 5.0）：0.5mol/L醋酸钠35ml，0.2mol/L醋酸15ml，加蒸馏水稀释至1000ml，混匀后测pH应为5.0；(7) 2mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠16.4g，用蒸馏水溶解后配成100ml；（8）95%乙醇。 二、实验操作 1.组织DNA的分离提取 （1）小鼠剪短颈动脉，放血处死，开腹取其脾及两肾（约0.3g），浸入预冷至0℃ （2）将组织剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA液7ml，旋转上下匀浆，至绝大部分细胞破碎为止。 （3）2500r/min离心15min，吸去上层液体，向沉淀中再加入0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA混匀，离心洗涤之（如欲获得RNA含量极少的纯DNA时，此步离心洗涤应重复多次）。 （4）经洗涤后的沉淀，加入3ml 0.14mol/L NaCl-0.01mol/L EDTA，在搅拌下缓缓滴入25% SDS 0.4ml，转入匀浆器内混匀，使沉淀悬浮均匀，再加入2mol/L的NaCl 4ml。此时，由于大部分脱氧核苷酸蛋白溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆一次使之均匀。 （5）转入三角瓶中，加等溶剂的氯仿-异戊醇约8ml，剧烈振摇10min，3000g离心10min，上层为水液，下层为氯仿，中间界面为变性蛋白质，吸出上清水液（如欲获得掺杂蛋白质较少的DNA，抽提和离心可重复多次，直至界面看不到变性蛋白质层为止）。 （6）上层水液边摇边加入等体积的95%乙醇，即可见有长纤维线状DNA析出，用玻棒搅拌，DNA及粘缠在玻棒上，瓶壁上尽量将水分挤干。 （7）缠在玻棒上的DNA纤维溶于1ml 0.1mol/L溶液中，待定量和电泳分析。 2.组织RNA的分离提取 （1）饥饿一天的小鼠，放血处死，解剖出肝，浸于预冷至0℃ （2）取0.3g肝，加入0.05mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0）3ml、25%SDS 0.5ml，移入匀浆管，匀浆后加入等体积80%酚，再匀浆一次。 （3）移入三角瓶中，置65℃ （4）3000r/min离心10~15min，上层水相含有RNA稍浑浊，中层为变性蛋白质，下层为酚液，管底残喳中含有DNA。吸出上层水液（若要提高RNA的收获量，可向中下层液中再加入1/2体积的醋酸缓冲液，重复65℃水浴振摇、离心步骤，合并两次的上层水液） （5）分别加入1/10体积的2mol/L醋酸钠、2.5倍体积遇冷的95%乙醇，混匀，于冷处放置至絮状沉淀充分形成。 （6）3000r/min离心10min，弃上清，离心管倒置于滤纸片上，尽量使液体流干。 （7）RNA沉淀用蒸馏水1ml溶解，待定量和电泳分析。 三、注意事项 1.DNA和RNA的提取操作应在4℃ 2.手上有RNA酶，提取RNA时应戴手套，尽量避免RNA酶污染。 3.提取DNA时，需待纤维状DNA大分子充分析出后，再用玻璃棒将其缠绕出来。 Trizol法是利用RNA和DNA在溶液中分布不同将其分开，RNA分布在水相中，DNA分布在有机相中，用乙醇将DNA沉淀下来。 其它的DNA提取方法：酚抽提法、甲酰胺解聚法、TRIzol法详见《组织与细胞培养技术》第267页