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双酶切连接反应之全攻略 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快 改善了 实验方法，用 2 周重组了 14 个质粒。现就自己的体会，结合 丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR 产物：在进行 PCR 扩增时候，给引物两端设计好酶切位点， 一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切 效率高的限制酶，如 BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公 用的 BUFFER，以及各酶在公用 BUFFER 里的效率。选好酶切位点后， 在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：。 双酶切时 及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全 没有必要，我一般酶切 3 个小时，其实 1个小时已经足够。应用大体系， 如 100 微升。 纯化问题：纯化 PCR 产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法 不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可 以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所 以，PCR 产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是 TAKARA 的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA 的为例，其对 1 单位酶的定义如下：在 50 μl 反应液中，30℃温度下反应 1 小时，将 1 μg 的λDNA 完全分解的酶量 定义为 1 个活性单位(U)。 而该酶浓度约为 15 单位/微升，在除外酶降 解的 因素外，该酶可分解 15μg 的 DNA，而一般从 1-4ml 菌液提出的 DNA 约为 3μg，而 PCR 纯化后的产物（50 体系）约为 3μg，所以即便全 部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的 PCR 产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的 PCR 产物片段=1 ：10　，一般取 前者 0.03pmol，后者取 0.3pmol。 pmol 为单位的 DNA 转换为为 µg 单位的 DNA ：（X pmoles×长度 bp×650）/ 1,000,000 （注：长度 bp×650 是该双链 DNA 的分子量）所得 数值即为 µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如 载体是 5380bp，则 0.03pmol 为 0.03×5.38×0.66=0.106524µg。 测 DNA 浓度可以在专用机子上测，注意 OD 值，一般约 1.8-2.0.另外， 如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5 微升的 MARKER 每个条带约 50ng。 连接反应：TAKARA 的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单 位的定义为：在20 μl 的连接反应体系中，6 μg 的 λDNA-Hind III 的分 解物在 16℃下反应 30 分钟时，有 90%以上的 DNA 片段被连接所需 要的酶量定义为 1 个活性单位（U）。而它的浓度为 350 U/μl ，所以完 全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时 3 个小时 足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 b 、42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 c、加入 890 μl AMP 阴性培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 取 100μl 铺板。也可离心后余 100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为 LIGASE 酶很容易降解.为保险起见,一般连接 3 小时,16 度. 2 对含有 AMP-RESISTENCE 的质粒铺板时,注意加 AMP 时的温度温, 度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤 箱里，烤箱一般温度为 55-60 度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温 度。铺板前后注意用吹风机吹干 3 对照的设立： 为验证双酶切是否成功,可做如下对照: A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种 BUFFER,跑胶,看单切 的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设 4 个: A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个