植物五种酶活性检测方法.docVIP

选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。 1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定 适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为7.2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。 取200ml初酶液，加入0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.6)200uL,混合反应液1.2ml（0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：0.1脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素1.2ml终止反应，460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。 酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加0.01为一个活性单位。 2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定 称取新鲜样品0.5g于预冷研钵中，加入6ml 0.1mol/L（pH8.8）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在4℃冰箱中浸提4h。4℃10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液。 取酶提取液0.2ml，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/L L-苯丙氨酸，2.8ml蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化0.01OD为一个活力单位。 3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定 取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。 以2.4ml0.1g/L亚油酸作为底物，加入0.1ml酶液在234nm处测定吸光值，每隔30s读数一次，共测5分钟。Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。 4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法） 取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[聚乙烯吡咯烷酮）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提12h。1000r/min离心20min,得到酶初提液。 取200mlPBS[磷酸缓冲液]（0.2M，pH6.0），加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30%的H202,混匀后保存于冰箱中备用。取3ml反应液并加入30ul酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定30s读数一次，5分钟）。（边加样边测定，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始计时的时间相差不大） 酶活性计算：以每分钟OD值得变化（升高）0.01为一个酶活性单位（u）。 POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/g?min)? ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。 5、过氧化氢酶（Catalase CAT）活性测定 取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提12h。1000r/min离心20min,得到酶初提液。 取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。 取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。（测定30s读数一次，5分钟）。 酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。 CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min) ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。