载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题培训课件.pptVIP

载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题 一、获取目的基因 二、重组 三、转化 反转录法 反转录-聚合酶链反应法 化学合成法 对已发现的基因的改造 载体选择 重组方法 受体细胞的选择 转化方法 方法 四、筛选 五、表达 筛选方法 注意的问题 抗性筛选，蓝白班筛选······ 是否容易产生抗性突变，是否有假阳性 融合表达 包含体表达 分泌型表达 表达方式 二、重组 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 M13噬菌体载体 噬菌粒载体 载体 （一）载体的选择 载体 表达型载体：如pUC18/19，pGEM-T载体 克隆型载体：如pBR322，TA载体 （二）重组方法：用T4DNA聚合酶将粘性末端连接起来 1.克隆基因的酶切位点问题 2.载体的酶切问题 3.连接片段浓度比的问题 需要考虑的问题： (1)黏性末端连接； (2)平末端连接； (3)同聚物接尾连接； (4)接头连接法。 三、转化 （一）受体细胞的选择 大肠杆菌 枯草杆菌 链霉菌 酵母菌 昆虫细胞（家蚕） 哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） 植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 常用的受体 大肠杆菌 用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms） 用于接受l-DNA：L