正向间接血凝检测技术.pptVIP

猪瘟正向间接凝集试验 猪瘟正向间接凝集试验 （一）试验原理 （二）适用范围 （三）试验器材 （四）试验方法 （五）结果判定 （六）注意事项 （一）试验原理 用已知的抗原检测未知血清抗体试验，称为正向间接凝集试验（IHA）。 猪瘟抗原与对应的抗体相遇，在一定的条件下会形成抗原抗体复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。 若将抗原吸附（致敏）在经过处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原抗体的反应灵敏性，这种经过猪瘟抗原致敏的红细胞与猪瘟抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。 （二）适用范围 主要用于检测猪瘟血清抗体效价 （三）试验器材 1．96孔110oV型血凝板，与血凝板大小相同的玻板 2．微量移液器（50ul、25ul）、取液吸头 3．微量振荡器 4．猪瘟血凝抗原 5．猪瘟阴性对照血清 6．猪瘟阳性对照血清 7．稀释液 8．待检血清（每头猪采血0.5-1ml即可） 释出血清后56 oC水浴灭活30min，灭活其中的补体 （四）试验方法 阴 稀 阳 检样1 检样2 检样3 ………. 检测区 对照区 1．加稀释液 在血凝板上1-6排的1-9（12）孔；第七排的1-3孔和5-6孔；第8排的1-12孔各加稀释液50ul。 2．稀释待检血清 取1号待检血清50ul加入第1排第1孔，吹打1-2次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔移出50ul移入第二孔，混匀后取出50ul移入第2孔，混匀后取出50ul移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50ul丢弃。 依次稀释2号、3号…. 注意！每取一份血清时，必须更换吸头。 3．稀释阴性对照血清 在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50ul，倍比稀释至第3孔，混匀后从该孔取50ul丢弃。 第5-6孔为稀释液对照。 4．稀释阳性对照血清 在血凝板第8排第1孔加阳性血清50ul，倍比稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50ul丢弃。 5．加血凝抗原 被检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔各加血凝抗原（充分混匀，瓶底应无血球沉淀）25ul。 6．混匀、孵育 将血凝板置于微量振荡器上振荡1-2min。如无振荡器，用手轻轻摇匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红细胞是否混匀，不出现血球沉淀为合格。 盖上玻板，室温下静置1.5-2h判定结果，也可延迟到翌日判定。 （五）结果判定 移去玻板，将血凝板放在白纸上 先观察阴性对照血清第3孔、稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血球大部分沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮）。 阳性血清对照1－8各孔应出现“++++－++”凝集为合格，（少量血球沉于孔底，大部分血球悬浮于孔内）。 在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。 “－” 表示完全不凝集或0-10%血球凝集 “+” 表示10-25%血球凝集 “++” 表示50%血球凝集 “+++” 表示75%血球凝集 “++++” 表示90-100%血球凝集 （六）注意事项 1．为使检测结果准确，检测前仔细阅读本说明书。 2．严重溶血或严重污染的血清样品不易检测，以免发生非特异性反应。 3．勿用90o和130o血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果。 4．用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球。再用蒸馏水或离子水冲洗2次，甩干水份放37oC恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37oC干燥备用。血凝板应定期浸泡在洗液中也可浸泡在5%盐酸液内，48h捞出后清水冲洗。 5．每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。 6．用不同批次的血球凝抗原检测同一份血清时，应事先用阳性血清准确测定各批次血凝抗原抗体的效价，取抗原效价相同或相近的血凝抗原检测待检血清抗体水平的结果是基本一致的，如果血凝抗原效价差别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。 7．收到本试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果。