转染技术原理及应用.pdfVIP

常规转染技术分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转 染）。前者外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可 存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和 其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染 后 24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统 如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源 DNA 既 可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线 性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中 概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选 性标记，如 来氨丙基转移酶（APH ；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸 苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化 DNA 与转 染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如 DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法， 电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理 及应用特点见下表： 转染方法 原理 应用 特点 磷酸钙 DNA 复 稳定 不适用于原代细胞 磷酸钙 合物吸附细胞膜被细 转染 操作简便但重复性差 法 胞内吞 瞬时性转 有些细胞不适用 第 1 页 共 15 页 染 带正电的 DEAE-右旋糖苷与核 相对简便、结果可重复 DEAE- 瞬时 酸带负电的磷酸骨架 但对细胞有一定的毒副作用 右旋糖苷法 性转染 相互作用形成的复合 转染时需除血清 物被细胞内吞 稳定 高脉冲电压破坏 适用性广但细胞致死率 转染 电穿孔 细胞膜 电位，DNA 通 高，DNA 和细胞用量大， 需 瞬时性转 法 过膜上形成的小孔导 根据不同细胞类型优化电穿 染 入 孔实验条件 所有细胞 通过侵染宿主细 病毒介 稳定 可用于难转染的细胞、原 胞将外源基因整合到 导法 转染 代细胞，体内细胞等 染色体中 但携带基因不能太大细胞需 逆转录 特定