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lｎcRNA研究策略与技术 研究背景: 长链非编码ＲNA(long　nｏncodｉnｇ ＲNA，lncＲNA)是一类不编码蛋白的ＲＮA分子，长度在20０ bp以上，起初被认为是RNＡ聚合酶ＩＩ转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNＡ具有保守的二级结构，可以与蛋白、ＤＮＡ和RNA相互作用,参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色,如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为mｉＲNA的诱导分子干扰基因的表达等,图1所示。随着高通量测序技术的发展,越来越多的lnｃRＮA被注释,但是绝大多数的ｌncRNA的功能仍然不清楚，因此lｎcRＮＡ的研究是一片非常广阔的未知领域,具有极大的研究价值和意义。 图1. lｎcＲＮA参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示lｎｃRNA。　A.染色质重组 Ｂ．转录激活和抑制 Ｃ.蛋白抑制　D．转录后修饰　Ｅ.诱导分子 锐博生物提供研究思路： 差异lncＲＮA筛选的研究方法：  案例解读: 案例(一)RNＡ seｑ发现ｌｉｎcRNA 1. 2011年,Ｒinｎ研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了８000多个人的ｌincRNA 图２．　A.利用ＲNA－seq预测lincRNA的流程图 Ｂ.多个参考数据库找到的lincＲNA的数量及交集及用软件组装的结果 2. lｉncRＮA的表达具有组织特异性 图3. lｉncRＮA和mRＮA在不同组织当中的表达情况 ?案例（二)lｎｃRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物 20１2斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症ｌｎｃRNＡ表达谱分析。对64个肿瘤样品高通量测序,在各种肿瘤类型之间找出差异表达的106５个已知的以及１07２新的lncRNＡ。 图4.肿瘤和对照样品ｌnｃRＮＡ表达谱分析 案例(三）ｌncRNＡ表达谱芯片结合lncRNＡ－mＲNA共表达网络筛选关键ｌncRNA 第二军医大学的研究人员利用2/3肝部分切除(PH）小鼠在不同的时间点,针对肝脏再生过程进行了全基因组ｌｎcRNＡ芯片表达谱分析。通过lｎcRNＡ和mRNA共表达网络分析找到了一个非常有意义的长链非编码RNＡ（ｌnｃＲNA－LALR1),并结合体内外实验证实在肝再生过程中ｌｎcＲＮＡ-LALR1通过激活Wnt/β－Cａtenin信号加速细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。因此采用药物干预靶向lｎcRＮA-LALＲ1诱导肝脏再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治疗。 1. 表达谱芯片检测肝脏生长相关的ｌncRNA 图5. 表达谱芯片聚类分析小鼠肝脏2/３切除后 0，1.５，12和24小时１231个lncRＮA和314１个mRNＡ表达谱 2. KEGG ｐaｔhway 分析与肝脏生长相关的信号通路 图6.　Pａthway 分析展示最相关的信号通路 3．　共表达网络分析找到关键的lｎcRＮA-LALR1 图７. 部分共表达网络分析,包含22个基因,１８个lncＲNＡ(k-coｒe=12)， 4个ｍRＮA（k-cｏre=１１　ａnｄ ｄeｇrees≥2８),位于中心位置的是lncRNA－LALＲ1 案例(四)lncRNA　功能研究 研究者对位于HOXA基因簇的5‘端启动子区域的非编码RNA HOTTIP进行了功能研究,研究证明HOTＴIP可以增强HOXＡ的转录;对HOTTIP体内外的干扰研究发现HＯTＴＩP在发育过程中起到重要作用，例如影响鸡远端骨的形成。 1. RT-PCＲ和ＦIＳH结果验证ｌｎcＲNA HOTTＩP的表达具有组织中特异性 图8. A.ＨＯTTＩP在人不同组织器官中的表达情况B. E1３.5小鼠胚胎上HＯＴＴIP的原位杂交 ２. 通过RNAi技术可以下调lncRNA HＯTＴＩＰ的表达量 图9． A． 针对HOＴＴＩＰ设计的ｓiRNA可以下调HOTＴIP基因及距离４０ kb左右的编码基因HＯXA13、HＯXA１1、ＨＯXＡ10、HＯXA9和HOXA7的表达量。B.对ＨＯTＴＩP基因的干扰不影响ＨOＸＤ基因和BIＤ基因的表达 3．　动物实验验证HOTTIＰ干扰载体的表达可以影响HoｘA基因的表达及骨质的形成。 图１0. A.　FISH结果显示HOＴTIP干扰载体在鸡胚胎中的过表达影响HｏxA基因的表达。Ｂ. HOTTIP基因表达量的下降导致远端骨头变短。??参考文献 1. Wang KC, Yａng YW, Liｕ B, et ａl.　Ａ　lｏｎg　nonｃodinｇ　RNＡ　maintainｓ ａctｉve ｃhrｏmatin to　coordinaｔe homeotｉc gene exprｅssion. Nature.2011;　47２(73４1)：　120–４． 2. Cabili MＮ,　Traｐnell C, Goｆf L,　et