引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC的区别.pdf

精品文档 引物纯化方式 HAP、PAGE、DHLPC等的区别 纯化方式： 一 OPC 纯化 OPC 纯化是使用一种叫 Cartridge 的反向层析柱 （美国 Waters 公司生产 ), 根据 DNA保 护基 (DMTr 基 ) 和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的 DNA片段。OPC法纯化的 DNA纯度大于 90%，适用于 PCR用引物， DNA测序用引物，各种探针等。此级别对短链较为 有效。 具体操作方法如下。 1. DNA 合成是用全自动 DNA 合成仪从 3 ‘→ 5 ‘进行人工合成的。在刚合成完的 DNA 的 5 ‘端的碱基上带有一个 大型的疏水性保护基团 DMTr 基，而中间产物的短链杂质 DNA 中 不具有 DMTr 基。利用这一性质进行目的 DNA 的纯化。 2. 把粗样 DNA 加入 Sep-Pak Cartridge 柱上 （简易反相柱 ) 。此时， 所有的合成产物全 吸附于反相柱上。 3. 用甲醇清洗反相柱。 此时，吸附能力强的带有 DMTr 保护基的目的 DNA 仍吸附于反相柱 上，而短链杂质 DNA 片段全部被冲走。 4. 向反相柱上加入强酸 TFA (Trifluoroacetic acid) , 切断 DMTr 保护基和目的 DNA 之间的连接。 5. 再用乙腈洗脱目的 DNA 。此时回收出来的目的 DNA 的纯度能达到 95% 以上 。可用于 DNA 测序等。 二 PAGE纯化 PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 对 DNA片段进行分离， 然后从凝胶中回收 目的 DNA的方法。 PAGE纯化法也是一种非常有效的 DNA纯化方法，纯化后的纯度大于 95%， 对长链 Oligo DNA 的纯化特别有效。适用于 PCR用引物， DNA测需用引物，各种探针等。 三 HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达 99%。适用于各种基因工程试验，特别是： 荧光标记 DNA、长链 DNA、 PCR克隆，定点突变，人工合成基因等。 HPLC 纯化 HPLC 纯化是使用高效液相色谱仪， 对目的 DNA 片段进行纯化的方法。 HPLC 纯化的设备投 资大，生产成本高，但使用本法纯化的 DNA 片段纯度极高，大于 99% 。 HPLC 纯化的操作 方法如下。 1. 合成高纯度级 DNA 制品时，在全自动 DNA 合成仪上，需自动脱去 DMTr 保护基。 2. 将粗样 DNA 注入分离性能极强的离子交换高效液相色谱系统， 进行粗检测， 确认主峰位 置、目的 DNA 含量等 。 3. 增加注样量，回收主峰平头部分。此时可达到去除杂质短链 DNA ，纯化目的 DNA 的目 的。 为了确保 DNA 的纯度，一般一次的纯化量为 1 OD 左右。 4. 将回收后的 DNA 进行纯度检测，确认纯度的可靠性。 。 1欢迎下载 精品文档 四 HAP 什么是 HAP？ HAP是英文 HIGE AFFINITY PURIFICATIION 的缩写。 HAP方法是生工自主开发的新型 oligo DNA纯化方法。。用 HAP纯化的引物纯度可达 98%