8.3体内样本前处理-1.pdf

体内样品的前处理--去除蛋白和液液萃取法 在测定体内药物及其代谢物时，除少数情况将体液作简单处理后直接测定外，一般在测 定之前要对样品进行适当的预处理，为药物的测定创造良好条件。样品的预处理是体内药物 分析中极为重要的环节，也是分析中最困难，最繁复的工作。 一、体内样品预处理的目的 1、使待测药物游离 药物进入体内后，即与血浆蛋白结合，同时部分经生物转化生成 代谢物及缀合物。通过预处理，使待测药物或代谢物从结合物或缀合物中释放出来，以便测 定药物或代谢物的总浓度。 2 、满足测定方法的要求 体内样品介质组成复杂、干扰多，而待测药物组分浓度低。 因此，需将样品进行适当处理，使组分得到净化和富集，以满足测定方法对分析样品的要求。 3、为了防止分析仪器的污染、劣化，提高测定灵敏度和选择性等。如采用HPLC 法测 定，为防止蛋白质在色谱柱上的沉积、堵塞，需要除去血浆蛋白质。预处理不仅可以延长色 谱柱的寿命，也可以改善方法的选择性（排除生物介质的干扰）和组分的可测性或组分的色 谱行为。 二、常用体内样品预处理方法 常用体内样品的预处理方法一般有蛋白沉淀法、液--液萃取法、液--固萃取法。特殊情 况下需进行缀合物水解、化学衍生化等。 （一）蛋白沉淀法 在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物释放出来，以便测定 药物的总浓度。去除蛋白法有以下几种方法。 1、溶剂沉淀法 加入与水相混溶的有机溶剂（亲水性有机溶剂），蛋白质分子间的静电 引力增加而聚集。常用的水溶性有机溶剂有乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆 或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1: （2~3 ）时，可以将90% 以上的蛋白质除去。上清液 偏碱性，pH 为8.5~9.5。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清混合后离心分离，取上清 液作为供试溶液。通常用于分离血浆或血清的离心力（约1000g ）不能将蛋白质沉淀完全， 而采用高速离心（离心力约15000g ）约5 分钟便可将析出的蛋白质沉淀完全。 2 、中性盐析法 加入中性盐，溶液的离子强度发生变化，部分蛋白质的电性被中和， 蛋白质因分子间电排斥作用减弱而凝聚。常用的中性盐有饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯 化钠、磷酸钠等。操作时，按血清与饱和盐溶液的比例为1: （2~3 ）混合，高速离心约2 分 钟，即可除去90% 以上的蛋白质。所得上清液近中性，pH 为7.0~7.7 。 3、强酸沉淀法 当溶液pH 低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，可与 酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液。含药物血 清与强酸的比例为 1 ∶0.6 混合，高速离心约2 分钟，就可以除去90% 以上的蛋白质。因加 入了强酸，上清液呈强酸性（pH 0~4 ），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。 4 、热凝固法 当待测物热稳定性好时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白质沉淀。 加热温度视待测组分的热稳定性而定，通常可加热至 90℃。蛋白沉淀后可用离心或过滤法 除去，这种方法最简单，但只能除去热变性蛋白。 （二）液--液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE ） 液-液萃取法是传统的分离、浓集方法。多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的 溶解度大于在水相的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性干扰物质是强极性的水溶 性物质，因而可用有机溶剂提取法除去大部分内源性干扰物质。 样品在提取过程中，虽然待测组分得到了净化，但因微量的组分分布在较大体积的提取 溶剂中，常需要使待测组分浓集后再进行测定。方法是挥去提取溶剂，残渣复溶于小体积的 溶剂。挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的 药物，可采用减压法挥去溶剂。溶剂蒸发所用的试管，底部应为尖锥形，这样可使最后数微 升溶剂集中在管尖，便于待测组分的复溶与分取。 应用液--液萃取法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH 等。 1、溶剂的选择 溶剂的选择应根据相似相溶的原则进行，选择溶剂时应注意：①对药物 分子的未电离形式可溶，而对电离形式不溶；②沸点低、易挥发；③与水不相混溶；④无毒、 不易燃烧；⑤具有较高的化学稳定性和惰性；⑥不影响紫外检测。 常用液-液萃取的溶剂 溶剂