细菌内毒素检查（凝胶限度法）PPT.pdf

药物分析 细菌内毒素检查法 ——凝胶限度法 目录 第一节 概念和原理 第二节 操作过程 重点难点 掌握 凝胶限度法的操作过程 熟悉 熟悉检查原理 了解 细菌内毒素检查法的历史 第一节 概念和原理 1. 概念 细菌内毒素检查是用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒 素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。细菌内毒素检查包括 两种方法，即凝胶限度法和光度测定法。 2. 原理 鲎试剂反应原理 第二节 操作过程 1. 试验前准备 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿 常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细 菌内毒素检查的适宜方法。 供试品最大有效稀释倍数的确定（ MVD）。MVD是指在试验中供试品溶 液被允许达到稀释的最大倍数( 1→MVD )，在不超过此稀释倍数的浓度下进 行内毒素限值的检测。如果供试品被无限稀释，可能导致内毒素检测不出来。 MVD cL /  式中：L 为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L 以EU/ml 表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以 EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供 试品的最小有效稀释浓度 ；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线 上最低的内毒素浓度。 2.鲎试剂灵敏度复核试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变 时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度 是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。 （1）试验方法：根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将一只细菌内毒素工作标 准品用细菌内毒素检查用水溶解，制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素 标准溶液，每一浓度平行做4管，另外2管阴性对照（共18管）。37℃±1℃的 恒温器中，保温60±2min。 （2）结果观察：将反应管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是 否变形和滑落判断试验结果。注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成 假阴性结果。 （3）结果判断与计算：若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴 性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。反应终点浓度的几何平均值，即为鲎 试剂灵敏度的测定值（λc）。 -1 λc=lg （∑X/4） 式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中 最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ~2λ （包括0.5λ和2λ）时，方可用 于内毒素检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 3.干扰试验 干扰试验是为了确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂 的反应不存在干扰作用，为产品能否用细菌内毒素检查法提供依据。当进行 新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时， 须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发 生了任何有可能影响试验结果的变化时，须进行干扰试验。 4.供试品检查——凝胶限度试验 按下表制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰 的供试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 编号 内毒素浓度／被加入内毒素的溶液 平行管数 A 无／供试品溶液 2 B 2