第六章 植物原生质体融合技术 黄秀梅.ppt

植物原生质体融合基本过程 植物细胞 A 植物细胞 B 原生质体 A 原生质体 B 原生质体融合 正在融合的 原生质体 再生出细胞壁 杂种细胞 愈伤组织 杂种植株 去细胞壁 纤维素酶 果胶酶 物理方法 化学方法： 离心 振动 电刺激 聚乙二醇 细胞分裂 植物组织培养 酶解法 人工诱 导方法 ◆ 盐类融合法 ◆ 高 Ca 2+ 和高 pH 值融合 ◆ 聚乙二醇（ PEG ）融合法 ◆ PEG 与高 Ca 2+ 和高 pH 值结 合融合法 ◆ 电融合法 A. 盐类融合法 ? 盐类融合剂种类 –硝酸盐类： NaNO3 、 KNO3 、 Ca(NO3) 2 –氯化物类： NaCl 、 CaCl 2 、 Mg Cl 2 、 BaCl 2 –葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 ? 盐类融合的优缺点 –优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小 –缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发 融合 B. 高 Ca2+ 和高 pH 值融合 ? Ca 2+ 浓度 0.05 mol/L ? pH 9.5-10.5 具体做法 ( 以烟草为例 ) ? 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以 1:1 的 比例混合 ; ? 加入 0.05mol/LCaCl 2 .2H 2 O 和 0.4mol/L 甘露醇 ; ? 再用甘氨酸钠缓冲 pH 值到 10.5 ，成为融合液， 同时在 37 ℃下保温 0.5h; ? 用 0.4mol/L 甘露醇洗净高 CaCl 2 和高 pH 值； ? 两种原生质体的融合率达到 10% 。 C. 聚乙二醇（ PEG ）融合法 ? Polyethylene glycol(PEG) 是一种多聚化合物 , 分子式 H(OHCH 2 -CH2) n OH, 平均相对分子量 200-20000 之间 ? 融合机制： 可能是由于带有大量负电荷的 PEG 分子和 原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电 键，促使异源的原生质体间的粘着结合 ? 用相对分子质量为 1540 的 PEG 处理 40-50 min ；再用 培养液缓慢稀释 PEG 最后洗去 PEG ，得到 10% 的异核 体 D. PEG 与高 Ca2+ 和高 pH 值结合融合法 ? 先用 PEG 处理 30min ；（ PEG 是相邻原生质 体表面间的分子桥） ? 然后用高 Ca 2+ 和高 pH 值液，稀释 PEG ； （引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布， 从而促进了融合） ? 再用培养液洗去高 Ca 2+ 和高 pH 值 PEG 诱导原生质体融合过程 E. 电融合法 ? 原理： – 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变， 使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始 连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 ? 优点： – 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、 方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去 PEG 诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 电融合基本过程 1. 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型 只有一个小室，平行电极型有 4 个小室，两电极间隔 3mm ， 整个装置放在一个培养皿中 2. 微电极型：用 5-12 微安的脉冲电流间断刺激 1-5 毫秒，原生 质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层 膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到 面连接，最后形成融合体 , 整个过程约 10-30 分 3. 平行多电极融合装置法：经过 1 兆赫如 150V/cm 交流电场发 生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极 子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流 电脉冲 (50ms,1.2-2KV/cm) 作用下，质膜发生被击穿，进一 步形成融合体 细胞电融合过程 第六章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion ◆ What 基本原理 ◆ Why 技术应用 ◆ How 技术方法 微 丝 叶绿体 线粒体 质 膜 液 泡 细胞核 内质网 微 管 细胞壁 高尔基体 植物细胞模式图 细胞壁由三种主要成分构成 纤维素 25-50% 、 半纤维素 53% 和果胶 5% ◆ What 基本原理 ◆ 去除植物细胞壁以获得大量的原生质体 ◆ 诱导原生质体融合形成杂种细胞 ◆ 筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化 ◆ 从细胞团，愈伤组织到最后成株 植物原生质体融合基本过程 植物细胞 A 植物细胞 B 原生质体 A 原生质体 B 原生质体融合 正在融合的 原生质体 再生出细胞壁 杂种细胞 愈伤组织 杂种植株 去细胞壁 纤维素酶 果胶酶 物理方法 化学方法： 离心 振动 电刺激 聚乙二醇 细胞分裂 植物组