感受态细胞制备及各种感受态的特点.pdfVIP

精品文档 感受态细胞制备 制备感受态常用的方法是电击法和 CaCl2 制备法，以下介绍 CaCl2 制备法： 1、可以从 -80 ℃冰柜中， 取出一支冻存菌株， 于事先照过紫外的超净台中， 用无菌的接种环 轻轻蘸取菌种后， 在无抗平板 （由于 Rocetta 含有氯霉素抗性， 需要涂布在氯霉素抗性的平 板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回 -80 ℃保存，在划线板上做好相应标记， 于 37℃培养过夜。 2、从 37℃ 培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆， 接种于 2mlEP 管中， 37℃ ，220rpm 震荡 培养约 6 个小时至对数生长中后期； 将该菌悬液以 1:100 的比例接种于 50ml LB 液体培养基 （2 瓶）中 ,37 ℃ 振荡培养 2.5 小时至 OD600=0.5。 注意：接种比例不得大于 1:10 。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（ 50ml ）中，在冰上放置 5~10min ； 注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接 均要严格按照无菌操作。 4、4 ℃ 5000g 离心 5 分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀， 4 ℃ 5000g 离心 5 分钟； Note ：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl -15%甘油混合溶液， 轻吹散， 冰浴 5 分钟，4 ℃5000g 2 离心 5 分钟； 6、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl2 -15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬 液。分装成 50~100 μl 的小份，贮存于 -70 ℃可保存半年。 含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl 2 制备方法 : 2 称取 0.28g CaCl ( 无水 , 分析纯 ), 溶于 50ml 重蒸水中 , 加入 15ml 甘油 , 定容至 100ml, 高压灭 菌。 感受态细胞的特征 感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源 DNA的状态。感受态细胞的特征： （1）细胞表面暴露出一些可接受外来 DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受 位点充分暴露） 。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使 DNA直接 穿过质膜进入细胞） 。（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的 DNA 分子不易被切除或破坏。 。 1 欢迎下载 精品文档 实验室常用的感受态细胞 1.DH5 α菌株 克隆菌株： DH5α是一种常用于质粒克隆和高拷贝质粒的稳定复制的菌株。 E.coli DH5 α在 使用 pUC系列质粒载体转化时，其 φ80lacZ ΔM15基因产物可与载体编码的 β－半乳糖苷酶 氨基端实现 α－互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 Rec A1 和 end A1 的突变有