miR-6857-3p对人巨噬细胞SpllO基因调控的功能学研究.pdfVIP

摘要 目的： 1.通过生物信息学网站预测靶向Sp110 的microRNA （miRNA）。2.通过在THP-1细胞中检测 miRNA 本底水平进一步筛选miRNA。3.应用双荧光素酶实验验证miR-6857-3p 和Sp110存在靶向关 系。4.应用实时荧光定量PCR（qPCR）技术研究miR-6857-3p对Sp110 的调控作用。5.研究miR-6857-3p 对卡介苗感染的巨噬细胞凋亡的影响。 方法： 1.用生物信息学网站 （TargetScan、miRDB 和miRTarBase）预测可能和Sp110 具有靶向关系 的miRNA （miR-6857-3p、miR-19a-5p、miR-4772-3p、miR-4659-5p 和miR-5696）。2.提取人巨噬细 胞 （THP-1细胞）中的总RNA，将miRNA 反转录为cDNA，应用qPCR 技术检测先前预测的5种 △ - ct miRNA 的本底表达水平，采用2 法计算相对表达量，筛选表达量最高的3种miRNA（miR-6857-3p、 miR-4659-5p 和miR-4772-3p）进行双荧光素酶实验。3.从数据库中获取miR-6857-3p、miR-4659-5p 和miR-4772-3p 与 Sp1103UTR 的结合序列，将序列克隆到psiCHECK-2 质粒中萤火虫荧光蛋白 3UTR 的下游，命名为Sp110野生型质粒 （psiCHECK-2-Sp110-3UTR）。同时构建miRNA 过表达质 粒 （miR-6857-3p mimic、miR-4772-3p mimic、miR-4659-5p mimic 和miRNAmimicnc）。分别将不同 miRNA 过表达质粒和Sp110野生型质粒共转染到293T 细胞，实验共分4 组，转染48 小时后进行荧 光活性测定。此外，将miR-6857-3p 与 Sp110 3UTR 的结合序列进行突变，将突变序列按同样方式 克隆到报告载体中，命名为Sp110 突变型质粒（psiCHECK-2-Sp110-3UTR-6857mut）。将miR-6857-3p mimic 和miRNAmimicnc 分别和Sp110 突变型质粒共转染到293T 细胞，转染48 小时后进行荧光活 性测定。4. 用佛波酯 （PMA）将THP-1细胞促分化为巨噬细胞，用miR-6857-3p 模拟物 （mimic） 和抑制物 （inhibitor）分别转染促分化后的THP-1细胞，24 小时后用qPCR 技术检测THP-1细胞中 miR-6857-3p 的表达量。对转染成功的THP-1细胞进行RNA 提取，之后反转录为cDNA，再进一步 △ - ct 应用qPCR 技术检测Sp110mRNA 的表达量，用2 法计算相对表达量，比较差异。5.用miR-6857-3p mimic 和miR-6857-3p inhibitor 分别转染促分化后的THP-1细胞，转染24 小时后用卡介苗 （Bacillus Calmette-Guérin,BCG）以感染复数 （MOI）10:1感染细胞，感染6 小时后记为0 小时，清洗去除多 余细菌，在24 小时时应用流式细胞技术检测巨噬细胞凋亡情况。 结果： 1.通过生物信息学网站筛选出靶向Sp110的miRNA为miR-6857-3p、miR-19a-5p、miR-4772-3p、 miR-4659-5p 和miR-5696。2.THP-1细胞中5种miRNA 表达水平检测显示miR-6857-3p 表达量最高， 之后依次为miR-4659-5p、miR-4772-3p、miR-19a-5p 和miR-5696。3.双荧光素酶实验结果显示与对 照组相比，携带miR-6857-3p mimic 和Sp110野生型质粒的荧光素酶活性产生明显下降（P 0.001）， miR-4659-5p 和miR-4772-3p 组的荧光素酶活性也出现降低 （P 0.05）。将Sp1103UTR 突变后 miR-6857-3p mimic 的荧光素酶活性出现回升。4.在THP-1细胞中转染miR-6857-3p mimic 后， miR-6857-3p 表达量升高。在THP-1细胞中转染miR-6857-3p i