原核表达总结.pdfVIP

原核表达之目的基因克隆 1. 了解实验课题对目的蛋白的要求，包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结 晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达 还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什 么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存 在是否会影响蛋白的活性）。 还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考， 注意稀有密码子的多少，位置5 位或3 位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测 等。 稀有密码子预测网址： .ru/eng/scripts/01_11.html /~mmaduro/codonusage/usage.htm /RACC/ /~sumchan/caltor.html 原核表达蛋白可溶性预测网址： / 综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌（做原核表达前对各种载体及宿主菌的充分 了解是必须的，建议首先应阅读《默克原核表达宝典》）。 注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则 是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。 一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的 方法来控制表达水平）。 2. 搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物； 注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有 相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点） 是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N 端还是在 C 端，若要在 C 端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则 引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入 His 的密码子）；另外， 还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变； 1，2 步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。 3. 摇菌，进行RNA 抽提（注意选取不同表现型的菌株），摇菌的时间一定不要太长，太长 的话RNA 活性不高； 4. mRNA 反转成cDNA （此步应在第三步完成后立即操作，RNA 存放时间长易降解）； 5. 以cDNA 为模板，利于设计好的引物进行PCR 扩增； 6. 通过胶回收试剂盒回收目的DNA 片段。 蛋白质表达载体构建步骤08.4.20 （08.11.10 日修改） 日期 时间 实验材料 实验内容 9:00 Insert DNA+T vector T 载体和外源片段连接 第一天 16℃反应5～6h 16:00 热激转化DH5a ，将片段涂布到含100ppmAMP 的LBA 平板上 37℃生长16h 左右，时间太长易形成卫星菌落；当晚准备验证所需的LB 液体培养液 挑取5 个单菌落进行PCR 验证，并摇菌；若平板上菌落少，可让其生长20h 左右； 8:00 将平板置于4 ℃冰箱中短期保存； 第二天 11:00 菌落PCR 电泳分析，确定阳性克隆 20:00 质粒提取（1h），阳性克隆菌株15％甘油保存D(X-T-N) ； 21:00 质粒电泳检测，保存pD(X-T-N) 8:30 小量质粒双酶切实验（HindⅢ、Nco Ⅰ），30ul 体系； 11:30 质粒双酶切电泳分析，确认含有Insert DNA 的质粒； 12:30 表达载体及质粒大量双酶切，150ul 反应体系，分装30ul； 第三天 16:00 质粒大量双酶切电泳 19:00 切胶回收及胶回收检测 20:00 T4 DNA Ligase 连接反应（pET32a 和Insert DNA ） 批注 [Y1]: 保存