Sp110基因沉默对巨噬细胞抗结核分枝杆菌的影响及功能研究.pdf

摘要 目的：通过特异的siRNA 构建Sp110 表达降低的细胞模型，在此基础上研究Sp110 对结核杆菌感染 后的巨噬细胞的影响，以便为促进抗结核基因的转基因合成以及发现治疗结核病的新方法奠定基础。 方法：利用Lipofectamin TM3000 Reagent 包裹siRNA 对巨噬细胞进行转染，进行实时荧光定量PCR 检测RAW264.7 细胞中Sp110 基因mRNA 水平的表达量，对细胞进行总蛋白的提取，利用Western Blot 方法检测转染后巨噬细胞中SP110 蛋白的表达情况。成功构建Sp110 低表达的巨噬细胞后，分别用 BCG 、H37Ra 感染巨噬细胞，于感染6 h 后对细胞进行清洗，去除细胞外的结核杆菌并将此时记为0 h 。利用抗酸染色分析巨噬细胞吞噬结核杆菌的情况，选取0 h 、24 h、48 h、72 h 四个时间段绘制细 胞生长曲线以了解增殖情况，利用流式细胞术分析细胞死亡情况。 结果：（1）siRNA 转染24h 后，阴性对照组细胞形态与空白对照相比未发生明显变化，细胞胞体呈 圆形，折光性强，胞内颗粒少；siRNA 组细胞胞体出现触角，胞浆中黑色颗粒增多；（2 ）经转染siRNA 24 h 后，与空白对照组相比siRNA 组Sp110 基因mRNA 表达量明显降低（P 0.01 ），与阴性对照组 组比较，siRNA 组mRNA 表达量明显降低 （P 0.01 ），空白对照及阴性对照之间比较无差异（P 0.05 ）；（3 ）siRNA 转染48 h 后， siRNA 组与空白对照组相比SP110 蛋白相对表达量明显降低（P 0.001 ），与阴性对照组比较siRNA 组SP110 蛋白表达量降低显著 （P 0.001 ），空白对照组与阴性对 照组蛋白表达量无差异（P 0.05 ）；（4 ）抗酸染色结果显示吞噬了至少一个抗酸杆菌的细胞占约30%， 说明结核杆菌感染后RAW264.7 细胞可以成功吞噬Mtb ；（5 ）细胞未感染结核杆菌时，在0 h - 24 h 之间增长迅速，在24 h - 48 h 生长最快，在48 h - 72 h 之间细胞增长减慢，Sp110 低表达不会对细胞 的增殖产生影响，用BCG 感染细胞时对照组呈上升趋势，Sp110 低表达会减慢细胞的增殖；H37Ra 感染细胞时对照组总体为上升趋势，低表达Sp110 会减慢细胞的增殖，但BCG 与H37Ra 感染对细 胞的增殖能力的影响没有明显的差别；（6 ）经BCG 感染后，对照组细胞的凋亡率为0.05%，siRNA 组细胞的凋亡率为4.7% ，两组之间有明显统计学差异 （P 0.001 ）；经H37Ra 感染后对照组细胞的 凋亡率为1.13%，siRNA 组细胞的凋亡率为7.7%，两组之间有明显统计学差异 （P 0.001 ）。 结论： 1. Sp110 低表达可以降低感染后巨噬细胞的增殖，但BCG 、H37Ra 在减缓巨噬细胞增殖方面没有差 异。 2.Sp110 的低表达可以增加巨噬细胞的凋亡，不同毒力的结核分枝杆菌诱导细胞产生不同的凋亡率。 关键词：Sp110；siRNA ；结核分枝杆菌；巨噬细胞 I Abstract Object: A specific siRNA was used to construct a cell model with reduced Sp110 expression, and on this basis, the influence of Sp110 on macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection was studied in order to lay the foundation for promoting the transgene synthesis of anti-tuberculosis genes and discovering new methods of treating tuberculosis. Methods: Macrophages were transfected with Lipofectamin TM3000 Reagent wrapped siRNA. Real-time quantitative PCR was used to detect the