二硫键封装固定化脂肪酶及其性能研究.pdfVIP

摘要 摘要 酶固定化过程中，酶分子能与载体发生共价偶联引起酶失活。为了保持酶 分子的活性构象，同时使酶固定更加牢固，我们在磁性微球载体表面设计了二 硫键封装的“鸟笼”结构进行酶的固定化研究。首先需要我们制备出聚乙烯亚胺 （PEI ）接枝的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA ）磁性微球，然后加入 3- （2-吡啶二 巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP ）改性接枝的PEI，然后通过电荷引力 诱捕吸附脂肪酶，最后用 2,2- （1,2- 乙二基双氧代）双乙硫醇（DMDO ）交联 SPDP，由此将酶包封固定化。主要内容包括以下几个部分： 第一，磁性微球的合成、接枝修饰、交联封装及其表征。首先通过共沉淀 法 （化学法）制备出油酸进行改性的 Fe O 磁粒子，以其为磁核 （Fe O 磁粒 3 4 3 4 子），采用悬浮聚合法合成了PMMA 磁性微球，并对微球进行了酯解酸化使其 携带羧基。滴定分析结果显示微球表面携带的羧基含量为 0.49 mmol/g 。然后将 PEI 接枝在微球表面制备出 PEI@PMMA 磁性微球，分析表明微球表面伯氨基 的含量为53.3 µmol/g 。进而用SPDP 修饰PEI 制备出SPDP-PEI@PMMA 磁性微 球，紫外分析显示 SPDP 的修饰量为9 µmol/g 。最后用DMDO 交联 SPDP，完 成封装，紫外分析结果显示交联后DMDO 的含量为4 µmol/g 。 第二，SPDP-PEI@PMMA 磁性微球交联封装固定化脂肪酶。首先，以 SPDP-PEI@PMMA 磁性微球为载体，通过电荷引力作用将假丝酵母脂肪酶 （CRL ）诱捕吸附在微球上。然后用 DMDO 交联 SPDP，从而将酶包封在内 部。荧光显微镜实验表明，CRL 脂肪酶被固定在微球载体的表面；高盐洗脱实 验结果显示，与吸附固定化酶相比，交联封装的 CRL 脂肪酶与载体间的结合力 明显增强，表明CRL 酶被成功交联封装在微球载体表面；解析蛋白质二级结构 的红外光谱表明，交联封装固定化酶的构象结构没有遭到破坏；酶活测定显 示，与游离 CRL 酶的活性（50 U/mg ）相比，交联封装固定化酶的活性提高了 14.2%。此外，实验还对交联封装固定化酶的交联时间、交联温度进行了考察， 结果表明，交联温度为 25 ℃、交联反应 1h 时所制备的固定化酶最优，其固载 量与酶活分别为28.8 mg/g 微球和57.1 U/mg 。 I 摘要 第三，磁性微球交联封装固定化酶的功能性研究。实验考查了交联封装固 定化CRL 脂肪酶的最佳温度、最适pH 、稳定性以及固定化CRL 的反复利用性 等酶学性质。结果显示，交联封装固定化酶的最佳温度为 37℃，最适 pH 为 7.5，与游离酶相同。但交联封装固定化酶的温度和 pH 适用范围与游离酶相比 都有明显扩大，且其热稳定性以及对变性剂耐受的稳定性也得到显著提高。重 复使用性实验结果显示，交联封装固定化酶在连续使用四次后，酶活仍然保留 了 55% 以上，而吸附法固定化酶的活性在使用四次后则大幅度下降，只保留了 最初活性的20% 。 关键词：磁性微球 交联封装 假丝酵母脂肪酶 SPDP 2,2- （1,2-乙二基双氧代） 双乙硫醇 II Abstract Abstract During enzyme immobilization, covalent coupling of enzyme molecules with the carrier