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生物学大实验（二） 实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验 实验目的 通过对智力扩增、 提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作， 加深对分子生 物学基本技术的理解和掌握。 实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、 磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。 实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的 培养来实现对质粒的扩增。 经过处理的线状 dna 在外界环境恢复正常的时候不能够复性 而质 粒 dna 可以复性，从而可以实现质粒 dna 和染色体 dna 的分离。限制性内切酶能特意地结合 于一端被称为限制性酶识别系列的 dna 系列之内或其附近的特异位点上，并切割 dna。当对 提取的质粒 dna 进行电泳时，同一质粒 dna 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的 泳动速度快。 实验步骤： 一 质粒扩增 （1）普通 lb 固体培养基制备： 制备 lb 培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。 （2）将大肠杆菌接种于 lb 培养基中， 37℃振荡培养过夜 (200 转/ 分 ) 二 质粒 dna 的提取 ( 碱法 ) 将菌液倒入 1.5ml 的微量离心管中， 12000rpm 离心一分 30 秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀； 、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。 3 、 加入 100μ l 用冰预冷的溶液 i ，剧烈振荡， 将沉淀彻底悬浮， 然后室温放置 5 分钟。 、 加入 200μ l 现配的溶液 ii ，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免 dna 断裂），使混合物混匀，冰浴 5～ 10 分钟。 、 加入 150μ l 预冷的溶液 iii ，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀 地分布于溶液 iii 中，冰浴 5 分钟。 6 、 取上部水相，移入新的离心管，加入 2 倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入 1/10 倍体积的醋酸钠） ，震荡混匀，室温放置 10 分钟沉淀双链 dna，然后 4℃，12000rpm 离心 10min。 7 、 弃去上清液， 将离心管倒置于卫生纸上， 使离心管底部的液体流尽后， 加 入预冷的 1ml 70 ％乙醇。 8 、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置 dna 干燥 5～ 10 分钟。 9 、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥 10 分钟或室温干燥。 10 、 将沉淀溶于 34υ lte 缓冲液或灭菌水（ ph8.0 ）中，储于 -20 ℃冰箱中 三 dna 酶切反应 1 、 将洁净干燥并经灭菌的 eppendorf 管（最好 0.5ml ）编号， 用微量移液枪分别加入 dna（υ l ）和相应的限制性内切酶反应 10×缓冲液 2υ l ，将管内溶液混匀后加入 0.5 υ l 酶 液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操 作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱 的时间，以免活性降低。 2 、 混匀反应体系后，将 eppendorf 管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上） ， 37℃水浴锅保温 2-3 小时，使酶切反应完全。 3 、 每管加入 2υ l0.1mol/l edta （ph8.0 ），混匀，以停止反应， 置于冰箱之保存备用。 四 dna 的琼脂糖凝胶电泳 1 、 取 5× tbe 缓冲液 100ml 加蒸馏水至 1000ml ，配成 0.5 × tbe 稀释缓冲液，待用。 2 、 胶液的制备：称取 3g 琼脂糖置于 1000ml 锥形瓶中，加入 300ml 0.5 ×tbe 稀释缓 冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为 1%琼脂糖凝胶液。加热过程中 要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸 发。 3 、 胶版的制备：想冷却至 50-60 ℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（ eb）溶液使其终浓 度为 0.5 υ lg/ml 。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出 现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入 0.5 υ × tbe 稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面 4 、 加样：取 20υ l 的酶解液与 2υ l10 ×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽 中，每加完一个样品要更换 tip 头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶 或将样品槽底部的凝胶刺穿 5 、 电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接