RTPCR常见问题分析讲义.pptVIP

资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 资料仅可参考，如有不妥，请联系本人改正或者删除。 * 2020年08月13日 RTPCR常见问题分析 RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 2.基因特异性引 物设计较差 3.RNA中有基 因组DNA的污染 遵循用于扩增引物设计的同样原则 1.使用扩增级DNase 1处理RNA。 2.设置没有逆转录的对照反应检测DNA污染 对策 对策 RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 4.形成引物二 聚体 5.镁离子浓度 太高 6.沾染外源 DNA 设计在3’端没有互补序列的引物。 对于每一个模板和引物组化优化镁离子浓度。 使用抗气雾剂和UDG酶。 对策 对策 对策 RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 问题三：产生弥散条带 RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 1.cDNA第一链产物的含 量过高 2. DNase降解DNA产生的 寡核苷酸的非特异性 扩增 3. PCR反应中引物过多 4. 循环数过多 5. 退火温度过低 1. 常规PCR步骤中减少模板 cDNA的量 2. 提取高质量RNA，防止被 DNA污染 3. 减少引物的用量 4. 优化PCR反应条件，减少 PCR的循环次数 5. 提高退火温度，防止非特 异性的起始及延伸 原因 对策 RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 问题四：灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物? RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 1、 初始模板RNA不充分：增加模板RNA的浓度。 2、 RNA被损害和降解：必要的话更换RNA。 3、 RNAse污染：维持无菌条件;加入RNase抑制剂。 4、 无效的cDNA：通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂。 5、 无效的PCR扩增：注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。调整cDNA合成温度或引物设计。 RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 问题五：信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物? 1、 反应中加的样品太多：降低模板的浓度。 2、 模板或PCR残余污染：隔离污染来源，更换试剂，使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。 RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 问题六：电泳后出现意外的条带 RNA? 1.被基因组DNA污染 2.用于第一链合成的寡聚dT或随机引物 3.PCR的低特异性 1.用DNase I预处理RNA . 2.使用基因特异性引物 . 3.优化PCR条件. 原因 对策 RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 问题七:产生大分子量的弥散条带 大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的。对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200） RTPCR常见问题分析 * 2020年08月13日 问题八： 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果 通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有