包涵体蛋白质复性即纯化策略.ppt

Topics in this Presentation 包涵体蛋白复性 蛋白纯化策略 开发纯化工艺的注意点 建立检测方法 确立目标 (纯度和产量) 目标蛋白的性质 使用不同原理的纯化方法 减少步骤 尽量减少每步之间样品条件的改变 选用高选择性的方法 - 提高效率 快速去除蛋白水解酶 在早期步骤中缩小样品体积 工艺方法尽量简单! 准备工作 考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济 蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点 样品准备 考虑: 根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 稳定样品 选择层析方法 若对目标蛋白或样品不大了解，可尝试以下方法： 用分离范围宽广的凝胶过滤介质如Superose, Sephacryl 依据分子量将样品分成不同组份 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白， 一步即可得到高纯度样品；亦可用各种活化偶联介质 偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质 体积大的样品，往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯 化；高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化 疏水层析用高盐吸附，低盐洗脱的原理，洗脱的样品 又可直接上离子交换介质；两种方法常被交替使用 The three stages in downstream processing 适用於三步纯化策略的层析技术 适用於三步纯化策略的层析技术 吸附性层析的凝胶基架在纯化步骤的选择 粗提 目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 STREAMLINE 扩张柱床吸附技术 配合STREAMLINE填料和层析柱使用 粗样无需离心，过滤，直接上柱 层析法回收率高，选择性多，可自动化 取代离心和超滤设备 中度纯化 目的 去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 中度纯化: 离子交换填料 精细纯化 目的 达到最终纯度 (去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术: 凝焦过滤/离子交换 / 疏水层析/反相层析 精细纯化: 凝胶过滤填料 Separating dimer and oligomers from monomer rhGM-CSF fr E.coli inclusion bodies 谢谢欢迎您随时和我们联系北京 (010) 8838 5742上海 (021) 5080 0260广州 (020) 8732 0255香港 (852) 2811 7575 Any chromatography separation will be a compromise between speed, capacity, resolution and recovery. The next few slides show the shift in focus with respect to these parameters, during a purification procedure. For a good description of this and the next two slides: see Ion Exchange Chromatography - Principles and Methods, code no 18-1114-21 ed. AA, p. 109 - 112. Normalemnte los procesos de purificación empiezan con grandes volumenes procedentes de extractos crudos o cultivos cellulares. Rapidez: Para reducir al máximo el tiempo de aplicación de la muestra y evitar proteolisis u otros efectos destructivos Capacidad: Escoger un gel de alta capacidad nos permitira reducir al máximo la “escala” de equipamiento que necesitamos Sacrificamos resolución. See Ion Exchange Chromatography - Principles and Methods, code no 18-1114-21 ed. AA, p. 109 - 112. 样品稳定性 离心后，测量 280 吸收和活性 pH：pH 2 - 9 (1 pH 间隔) 盐：0-4 M