05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精).docVIP

天津现代职业技术学院 PAGE 1 3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力 原理 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 反应过程如下： 仪器、试剂 仪器 具塞玻璃刻度比色管：25mL×19； 烧杯：100mL×4； 三角瓶：100mL×1； 容量瓶：100mL×3，50mL×3； 刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1； 沸水浴； 冰浴； 扭力天平； UV—2802SH型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 试剂 1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。 操作步骤 葡萄糖标准曲线的绘制 取7支25mL具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 管号 1mg/mL葡萄 糖标准液（mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 葡萄糖含量 （mg） 光密度值 （OD540nm） 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 ? 2 0.4 1.6 1.5 0.4 ? 3 0.6 1.4 1.5 0.6 ? 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 ? 6 1.2 0.8 1.5 1.2 表1 葡萄糖标准曲线制作 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，做出标准曲线。 糖化酶活性测定 将糖化酶粉剂或浓缩液稀释至20~40单位/毫升，制成酶制备液； 取甲、乙两比色管（50毫升），分别加入2%可溶性淀粉溶液25ml和0.1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液5ml，摇匀，放入40℃士0.2℃的恒温水浴锅中水浴5-10分钟； 在甲管中加酶制备液2ml,摇匀，并记录时间，反应10分钟后,立即加入20% NaOH溶液0.2毫升,摇匀； 将两管取出冷却,并于乙管中补加入酶制备液2毫升(作为空白对照) ； 取上述反应液2毫升放于盛有2毫升3,5一二硝基水杨酸的25毫升比色管 中,按工作曲线的步骤以乙管为空白测其吸光度。由吸光度值从工作曲线上查得葡萄糖的毫克数,再按下面的公式计算酶活力单位。 四、计算 以1克酶粉剂或1升发酵酶液在40℃时pH为4.6条件下,1小时分解可溶性淀粉产生1毫克葡萄的酶量定义为一个酶活性单位。 式中：1/2一折算成1毫升酶液的量； 3 2.2 一反应液总体积的毫升数， (2)一吸取反应液毫升数; 60/10一转化成1小时的活性 n一稀释倍数; k一常数(包括时间,双糖影响等)