《生物化学》实验指导(8个实验).doc

PAGE PAGE 1 生物化学实验指导 吕杰 编著 新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室 内容介绍 《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。 目 录 实验一 氨基酸纸层析 ……………………………………………4 实验二 DNS-CL法测定N末端氨基酸………………………… 5 实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度………………………7 实验四 酪蛋白的制备…………………………………………… 8 实验五 葡萄糖标准曲线的绘制…………………………………10 实验六 酵母蔗糖酶的提取及活力测定…………………………12 实验七 酵母RNA的分离及组分鉴定……………………………14 实验八 维生素C的定量测定……………………………………16 实验一 氨基酸纸层析 一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。? 　 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。　溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率 Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器:? 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂： （1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。 （2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； （3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升 四、实验步骤：　 纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿 2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔 2cm 画一个“+”作为点样位置，共 5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点 5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在 2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。　 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约 1.5cm，约 50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。　 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的 Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 　　 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离 六、思考题：? 1、何谓分配层析法和分配系数？ 实验二 DNS-Cl法测定N末端氨基端 一、实验目的 学习聚酰胺薄膜层析的方法。 学习DNS-Cl测定氨基酸的原理及方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。? 　 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验器材 层析缸 毛细管 紫外灯 烘箱 恒温箱 聚酰胺薄膜 吹风机 2、试剂： = 1 \* GB3 ① 各种层析纯标准氨基酸 = 2 \* GB3 ② DNS-Cl丙酮溶液 （称取25mg DNS-Cl溶于10mL丙酮中，贮于棕色瓶中，至于冰箱保存，一个月内稳定） = 3 \* GB3 ③ 0.2mol/L NaHCO3 溶液 = 4 \* GB3 ④ NaOH 1M = 5 \* GB3 ⑤ HCl 1M = 6 \* GB3 ⑥ 展开剂I