第8章基因工程.pptxVIP

第8章基因工程;基因工程;2、基因工程的意义 1) 获得大量的有应用价值的酶：纤维素酶 2）得到有药用价值的生物制品：尿激酶 3）改造工业用微生物 4）可对一些疾病进行基因治疗;3、基因工程的基本环节 1）目的基因的获得 2）目的基因克隆 3）导入宿主细胞 4）表达;原核基因工程各环节浅析;2、DNA重组 1）DNA分子重组技术 在体外把特定的DNA片段插入核酸载体中并形成磷酸二酯键连接，从而组合成一个新的DNA分子。 2）载体：基因的渡船 一个可结合特定DNA片段并把它转运进细胞中的物质。常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 ;载体的特点 ①能在宿主细胞中复制繁殖，复制能力越高越好。 ②容易进入宿主细胞，效率越高越好。 ③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切??位点。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来　　 ⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。 　　;克隆载体　为了基因克隆而用于携带DNA片段进入宿主细胞的自动自我复制的遗传成分。常用的载体是细菌质粒与修饰过的噬菌体基因组。 常用的克隆载体： 1）质粒 （10kb) 2）λ噬菌体(9-23kb)：以多克隆位点与筛选标记代替费必需区。 3）粘性质粒(40-50kb)：带有cos区的载体 ;表达载体　携带基因或c DNA 进入恰当的宿主细胞,并引导编码蛋白合成的经修饰的质粒或病毒。一般带可被宿主细胞识别的有基因表达调控元件：启动子，核糖体结合位点，转录终止序列。 ;质粒载体;;;常用的重组方法 1）粘性末端连接 2）加上同聚体的尾部 3）加人工接头 4）平末端连接;目的基因与载体重组;;;3、把重组DNA导入宿主细胞 1)转化：将质粒或其他DNA导入宿主细胞，并使其获得新的表型。 采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。 例：冷CaCl处理制备感受态细胞 用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法 2）感染：噬菌体感染细菌 3）转染：重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。 ;4、转基因后的鉴定 1）根据重组载体的标志作筛选 2）核酸杂交法 3）PCR法 4）DNA限制性内切酶图谱分析 5）核苷酸序列测定 6）基因的表达产物鉴定 免疫印迹（Western-blot） ;克隆基因的表达 原核常用表达体系：大肠杆菌 E.coli ori+抗性基因+ E.coli启动子+SD序列+克隆位点+终止信号 表达产物 基因表达的鉴定;原核基因工程流程图;真核基因工程各环节浅析;DNA的扩增 重组质粒转化大肠杆菌，挑出成功的克隆，大量培养培养，获得重组的质粒。;导入真核宿主细胞 常用方法： 磷酸钙共沉淀 电穿孔 脂质体 显微注射法;克隆的筛选 导入成功克隆的筛选 1、抗性基因与药物筛选 G418与neor基因 2、绿色荧光蛋白;;真核表达 常用的真核表达系统： 1、昆虫表达系统：例，果蝇S2细胞 2、杆状病毒表达系统：例，Sf9细胞系 3、酵母的表达系统 有些时候会采用哺乳动物细胞;基因表达的鉴定 mRNA的检测 蛋白的检测;文献的阅读与分析;1、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。五月-20五月-20Tuesday, May 26, 2020 2、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。20:37:0620:37:0620:375/26/2020 8:37:06 PM 3、越是没有本领的就越加自命不凡。五月-2020:37:0620:37May-2026-May-20 4、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。20:37:0620:37:0620:37Tuesday, May 26, 2020 5、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。五月-20五月-2020:37:0620:37:06May 26, 2020 6、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。26 五月 20208:37:07 下午20:37:07五月-20 7、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。。五月 208:37 下午五月-2020:37May 26, 2020 8、业余生活要有意义，不要越轨。2020/5/26 20:37:0720:37:0726 May 2020 9、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。8:37:07 下午8:37 下午20:37:07五月-20 10、你要做多大的事情，就该承受多大的压力。