植物生理学 实验3 NR活性测定.pptVIP

实验二 问题分析 – 气孔密度 （单位）： 固定法比印迹法多 – 气孔大小 （开度） ： Na + 可以代替 K + ，但效 果较差 – 取样时间、位置及照光时间 实验三 硝酸盐和光诱导对硝酸 还原酶活性的影响 硝酸盐还原 ? 硝酸盐的还原由硝酸还原酶 (nitrate reductase) 催 化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。 ? 诱导酶 (induced enzyme) 植物体本来不含有，但在特定的外来物质 ( 如底物 ) 的影响下诱导形成的酶 NR 基因表达的调控 实验证明 NO 3 - 能诱导 NR 的表达 ? NO 3 － 的还原在根或叶中 均可进行 ? NO 3 － 供应少时，主要在 根中还原 ? NO 3 － 供应量大而根中还 原力不足时， NO 3 － 运 到叶片进行还原 一 实验目的 ? 理解硝酸还原酶的特性； ? 掌握硝酸还原酶活性测定方法。 实验原理 ? NR 是诱导酶，在取样前一天用 50mM KNO 3 - 或 NaNO 3 - 加到培养苗的水中以诱导硝酸还原酶的产生。 ? NO 2 - 产生 NO 3 - +NADH + + H + → NO 2 - +NAD + +H 2 O 外界溶液中的 NO 3 - 渗入植物组织后，经硝酸还原酶作 用，所产生的 NO 2 - 可以从组织内渗透到外界溶液中； ? 测定反应溶液中 NO 2 - 含量的增加，即表现该酶活性的 大小。 在一定条件下， NO 2 - 的生成量 与 硝酸还原酶活性 呈正相关。 NO 2 - 含量的测定用 磺胺比色法 。在酸性溶液中磺胺与 NO 2 - 形成重氮盐，再与 α - 萘胺偶联形成红色的偶氮化合物，可用 分光光度计在 540nm 下比色测定。 NH 2 NO 2 - 含量测定 NO 2 - 含量测定 当磺胺与 α - 萘胺均过量时，所生成的红色深浅与 NO 2 - 含 量成直线关系。 NO 2 - 含量标准曲线： [ NO 2 - ] （ μ Mol / ml ） = 0.0026 ＋ 0.359 OD 540 硝酸还原酶活性测定 NR 酶活性（ NO 2 - μ Mol/h?gfw ） = [ NO 2 - ] × 10ml/1ml ÷（鲜重 g × 0.5h ） 三 材料与方法 两种处理的小麦材料 [ 水（ W ）， KNO 3 （ N ） ] A 液 磷酸缓冲液： 水 ： DNP 溶液：蔗糖溶液＝ 5 ： 5 ： 1 ： 1 B 液 磷酸缓冲液： KNO 3 ： DNP 溶液：蔗糖溶液＝ 5 ： 5 ： 1 ： 1 磺胺试剂 α - 萘胺试剂 四 实验步骤 1 两种材料 [ 水（ W ）， KNO 3 （ N ） ] 各取 2 份新鲜叶片中段，用 蒸馏水洗净、擦干，剪成 0.5 cm 小段，各称取 0.3 克两份； 2 将两份（ W 、 N ）叶段分别置于含有 10 ml A 、 B 溶液的两只试 管中，即 WA 、 WB ， NA 、 NB 四管 ( 每个试管塞蓝色纱网 ) ； 3 将试管放在真空干燥器中抽气 0.5h ，放气后摇晃直至叶段沉于 溶液中； 4 将试管置于 25-30 ℃ 温箱中黑暗保温 0.5h ； 5 取四支试管，标号为 WA ′ 、 WB ′ ， NA ′ 、 NB ′ ，分别吸取 1ml 对应反应液，各加入 2ml 磺胺试剂和 2mlα - 萘胺试剂 （注意 顺序）， 混合摇匀， 25 ℃ 水浴 5min ，取出室温静置 25min 。 6 再取两支试管分别取 A 液或 B 液 1ml 代替反应液，各加入 2ml 磺胺 试剂和 2mlα - 萘胺试剂。设 空白对照管 在 540 nm 测定吸光值。 表 硝酸还原酶的活性 处 理 A 液 B 液 吸光度 吸光度 OD B -OD A NR 活性 H 2 O KNO 3 五 结果记录、计算 [ NO 2 - ] （ μmol/ml ） = 0.0026 ＋ 0.359 OD 540 酶活性（ NO 2 - μ mol/h?gfw ） =