细胞培养 原代培养 传代培养.pptVIP

酶标仪 微孔板震荡器 Culture flask Culture Plate 培养器皿 ? 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（ 24 小时）、 ? 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、 50 ℃烘干 ? 常用玻璃器皿清洗 清洁液的配制 细胞培养基 ? 干粉培养基和液体培养基 ? 干粉培养基需使用者自己配制并灭 菌，其优点是价格便宜。缺点是配 制过程繁琐，质量不易控制 ? 液体培养基是由专业厂家按标准规 模化生产，不仅质量得到保证，而 且使用十分方便 ? 常用的培养基种类 ? RPMI-1640 （标准型）、 DMEM- 高糖 （标准型）、 DMEM- 低糖（标准型）、 McCoys 5A 、 M199 、 F12 等 培养基的选择 没有一定的标准，有几点建议可供参考 ： 1. 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的 培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 2. 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合 多种细胞。 3. 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生 长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳 培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 血清使用注意事项 1. 血清必须贮存于– 20 ～ - 70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用 完一瓶，可将 40 ～ 45 ml 分装于无菌 50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加 约 10 % ， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 血清解冻步骤 ( 逐步解冻法 ): - 20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后 再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀 ( 小心勿造成气泡 ) ，使温度与成分均一，减 少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白 质凝结而发生沉淀。 3. 热灭活（ heat-inactivation ）是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处 理之目的是使血清中之补体成份 (complement) 去活化。除非必须，一般不建议作 此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。 4. 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质 ? 凝絮物： 发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白 (lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白 (fibrin) 造成， 这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀 物，可用离心 3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培 养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会 阻塞过滤膜。 ? 显微镜下观察之“小黑点”： 通常经过热处理之血清，沉淀物的形 成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常 会误认为血清遭受污染，而将血清放在 37 ℃中欲培养此“微生物“， 但在 37 ℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖， 但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应 不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换 另一批号的血清。 血清沉淀物 如何避免沉淀物的产生 ? ? 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法 (-20 ℃至 4 ℃至室温 ) ，若血清 解冻时改变的温度太大 ( 如 -20 ℃至 37 ℃ ) ，实验显示非常容易产生沉淀物。 ? 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发 生。 ? 请勿将血清置于 37 ℃太久。若在 37 ℃放置太久，血清会变得混浊，同时 血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 ? 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。 ? 若必须做血清的热灭活，请遵守 56 ℃， 30 分钟的原则，并且随时摇晃均 匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。 谷氨酰胺 ? 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添 加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置 7 天 即可分解约 50% ，所以都是在使用前添加 ? 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置 2 周以上时，要重新 加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加 入培养