资料细胞自噬与肿瘤.pptVIP

2.1、 细胞免疫荧光 LC3-Ⅰ在胞浆内弥散分布，LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上，通过免疫荧光的方法检测内源性LC3或转染GFP-LC3 融合蛋白的表达，自噬诱导后的细胞表现为点状聚集增多。理论上，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况。 但是这种方法仅从总体上大致反映自噬的增加或减少，定量分析则存在局限性。 ..... *  GFP-LC3 单荧光自噬指示体系： 绿色斑点增多也并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证。 ..... * 2.2 、LC3 蛋白转化 实验 自噬发生后，通过Western-blot 可以检测到两个条带的蛋白质。由于在自噬时细胞内LC3 蛋白总的表达水平其实并无上调，仅仅是一部分LC3 -Ⅰ转变成了LC3 -Ⅱ，那么理论上自噬时应表现为LC3 -Ⅰ的减少和LC3 -Ⅱ的增加，通过LC3 -Ⅱ/LC3 -Ⅰ或者LC3 -Ⅱ/(LC3 -Ⅰ+LC3 -Ⅱ)即可反映自噬水平。 ..... * 但是由于二者对抗体结合能力的差异导致检测敏感性的不同(LC3-Ⅱ检测敏感性高于LC3-Ⅰ)，实际检测结果LC3-Ⅰ的减少并不与LC3-Ⅱ的增加同步，因此单纯比较LC