拟南芥COPII复合体组分Sar1调控花粉发育的研究.pdfVIP

符号说明 COPII: coat protein complex II, 细胞质被膜复合体II CRISPR/Cas9: clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR- associated protein9, CRISPR/Cas9 基因编辑技术 DAPI: 4,6-diamidino-2-phenylindole, 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 DN: dominant negative mutant, 持续失活形式 ER: Endoplasmic reticulum, 内质网 GAP: GTPase activating proteins, GTP 水解酶活化蛋白 GEF: guanine nucleotide exchange factor, 鸟苷酸交换因子 GFP: green fluorescent protein, 绿色荧光蛋白 GUS: β-glucuronidase, β-D-葡萄糖苷酸酶 LB: luria-bertani medium, LB 培养基 MS: murashige and skoog media, MS 培养基 PCD: Programed cell death, 程序性细胞死亡 ProA9 : promoter of A9, 绒毡层中特异表达的基因启动子 qRT-PCR: Quantitative real-time reverse transcription PCR, 定量实时反转录PCR RNA: Ribonucleic acid, 核糖核酸 RNase A: Ribonuclease A, 核糖核酸酶A RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction, 反转录聚合酶链式反应PCR Sar1: secretion-associated Ras-related protein 1, 分泌相关Ras 蛋白1 SEM: scanning electron microscope, 扫描电子显微镜 TUNEL: TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, 末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺 口末端标记 目录 中文摘要 1 Abstract 3 1 前言 6 1.1.1细胞内膜系统 6 1.1.2 COPII复合体 7 1.1.3 COPII复合体组分 8 1.1.4 Sar1功能的研究现状 10 1.2花粉的发育 12 1.2.1孢子体调控的花粉发育 13 1.2.2配子体调控的花粉发育 15 1.3本研究的目的及意义 16 2 材料与方法 18 2.1材料 18 2.1.1植物材料以及生长条件 18 2.1.2菌株和质粒 18 2.1.3酶和生化试剂 18 2.1.4 PCR 引物 19 2.2方法 20 2.2.1突变体 20 T-DNA突变体的选择和订购 20 CRISPR-Cas9构建突变体 20 突变体鉴定引物的设计 21 植物基因组DNA 的提取（小量法） 21 基因组DNA水平鉴定突变体 22 植物总RNA 的提取（试剂盒法） 22 反转录 23 RNA水平鉴定突变体 24 2.2.2表达载体的构建 24 Phusion PCR扩增 24 PCR产物回收（试剂盒法） 24 TOPO连接反应 25 大肠杆菌的转化 25 质粒的提取（试剂盒法） 25 LR反应 26 质粒DNA 的酶切鉴定 26 2.2.3农杆菌介导的拟南芥遗传转化和转基因植株的筛选鉴定 26 根瘤农杆菌的转化 26 拟南芥的转化 27 拟南芥转基因植株的筛选鉴定 27 2.2.4 qRT-PCR 28 2.2.5 GUS染色分析 28 2.2.6拟南芥花粉染色及外壁形态观察 29 亚历山大染色 29 DAPI染色 29 扫描电子显微镜镜观察 29 2.2.7组织学切片 29 石蜡切片 29 树脂切片 30 2.2.8 TUNEL细胞凋亡检测 31 2.2.9光学切片 32 2.2.10激光共聚焦显微镜观察及图像处理 32 3 结果与分析 33 3.1 Sar1s 的功能分析以及Sar1b突变体的创制 33 3.1.1 Sar1a和Sar1c功能缺失突变体生长发