氟苯虫酰胺抗性对小菜蛾生殖的影响机制初探.pdfVIP

目 录 摘 要Ⅰ Abstract Ⅱ 1 前 言 1 1.1 小菜蛾研究概况 1 1.1.1 小菜蛾简介 1 1.1.2 小菜蛾抗药性的发展 1 1.2 氟苯虫酰胺研究概况 2 1.2.1 氟苯虫酰胺简介 2 1.2.2 氟苯虫酰胺作用机制 3 1.2.3 氟苯虫酰胺的生态风险 3 1.2.4 小菜蛾对氟苯虫酰胺抗药性的发展 3 1.3 害虫抗药性和生殖力的关系 4 1.4 卵黄原蛋白及其受体相关研究 4 1.5 卵黄原蛋白及其受体的激素调控 5 1.5.1 保幼激素 5 1.5.2 蜕皮激素 7 1.6 海藻糖酶与海藻糖酶基因 8 1.7 选题的目的和意义 8 1.8 技术路线 9 2 材料与方法 10 2.1 供试昆虫与饲养 10 2.1.1 供试昆虫 10 2.1.2 供试昆虫饲养 10 2.2 室内毒力测定和抗性诱导 10 2.2.1 毒力测定 10 2.2.2 抗性诱导 11 2.3 荧光定量 11 2.3.1 小菜蛾总RNA 的提取 11 I 2.3.2 小菜蛾总RNA 检测 12 2.3.2.1 总RNA 浓度和纯度检测 12 2.3.2.2 总RNA 的完整性检测—琼脂糖凝胶电泳 13 2.3.3 小菜蛾双链cDNA 合成 13 2.3.4 荧光定量PCR 14 2.4 酶液提取及活性测定 15 2.4.1 酶液提取 15 2.4.2 海藻糖酶测定 15 2.4.3 蛋白浓度测定 16 2.5 超高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS ）检测 16 2.5.1 仪器与试剂 16 2.5.2 标准溶液的制备 17 2.5.3 小菜蛾血清采集 17 2.5.4 样品前处理 17 2.5.5 色谱条件 17 2.5.7 质谱条件 17 2.6 卵黄蛋白含量测定 18 3 结果与分析 20 3.1 小菜蛾抗性水平测定 20 3.1.1 两种小菜蛾品系/种群对氟苯虫酰胺毒力测定 20 3.1.2 氟苯虫酰胺对小菜蛾的抗性汰选 20 3.2 不同品系/种群小菜蛾生殖相关基因表达差异与酶活性分析 22 3.2.1 小菜蛾总RNA 提取及cDNA 合成 22 3.2.2 引物验证 22 3.2.3 不同品系/种群小菜蛾卵黄原蛋白基因表达差异 24 3.2.4 不同品系/种群小菜蛾卵黄原蛋白受体基因表达差异 25 3.2.5 不同品系/种群小菜蛾卵保幼激素受体基因表达差异 26 3.2.6 不同品系/种群小菜蛾海藻糖酶基因表达差异和酶活性差异 29 3.2.6.1 不同品系/种群小菜蛾海藻糖酶基因表达差异 29 3.2.6.2 不同品系/种群小菜蛾海藻糖酶活性变化 31 Ⅱ 3.3 卵黄原蛋白的含量测定 33 3.4 超高效液相色谱- 串联质谱法检测不同品系/种群小菜蛾 4 龄幼虫血清中保幼激素和 蜕皮激素的含量 34 3.4.1 色谱和质谱条件优化 34 3.4.2 标准曲线的制作 36 3.4.3 样品的前处理、回收率、精密度和定量限 36 3.4.4 小菜蛾幼虫血清中β -蜕皮激素和保幼激素的含量 37 4 讨论 39 4.1 昆虫生殖与抗药性的关系 39 4.2 卵黄原蛋白与相关激素的含量分析 39 4.3 卵黄原蛋白相关基因与保幼激素受体基因的表达量分析 40 4.4 海藻糖酶对昆虫生殖发育的影响 41 5 结论 42 5.1 获得氟苯虫酰胺高抗水平的小菜蛾 42 5.2 小菜蛾不同品系卵黄原蛋白与相关激素的含量差异 42 5.3 小菜蛾不同品系卵黄原蛋白相关基因与保幼激素受体基因的表达量差异 42 5.4 海藻糖酶对昆虫生殖发育的影响 42 6 创新点 43 7 参考文献 44 8 致谢 52 9 攻读学位期间发表论文情况 51 III 山东农业大学硕士学位论文