禾谷镰刀菌FgCNA和FgCNB基因沉默载体的构建及其对禾谷镰刀菌生理功能影响的研究.pdfVIP

符 号 说 明 CNA: CalcineurinA, 钙调神经磷酸酶A CNB: CalcineurinB, 钙调神经磷酸酶B DON: Doexynivalneol, 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 dsRNA: Double-stranded RNA, 双链核糖核酸 FHB: Fusarium Head Blight, 小麦赤霉病 HIGS: Host-induced gene silencing, 诱导的基因沉默 miRNA: MicroRNA, 非编码小分子RNA RNAi: RNA interference, RNA 干扰 RISC: RNA-induced silencing complex, siRNA 蛋白复合体 PEG: Polyethylene glycol, 聚乙二醇 PTGS: Post-transcriptional gene silen-cing, 转录后基因沉默 QTLs: Quantitativetraitlocus, 数量性状位点 SIGS: Spray-induced gene silencing, 喷雾诱导的基因沉默 siRNA: Small interfer-ingRNA, 小干扰RNA TGS: Tran-scriptional gene silencing, 转录水平上的基因沉默 ZEA: Zearalenone, 玉米赤霉烯酮 目录 中文摘要 1 Abstract 2 1 前言 4 1.1 RNA 干扰 5 1.2 基因沉默技术在治理小麦赤霉病中的最新研究进展 6 1.2.1 小麦赤霉病 6 1.2.2 禾谷镰刀菌及其侵染过程简介 7 1.2.3 FHB 的防治策略 7 1.2.4 RNAi 与寄主诱导的基因沉默 8 1.2.5 HIGS 与禾谷镰刀菌引起的赤霉病 9 1.2.6 优势与挑战 10 1.2.7 RNAi 的应用 13 1.3 钙调神经磷酸酶 14 1.3.1 钙调神经磷酸酶简介 14 1.3.2 钙调神经磷酸酶的作用 14 1.4 RNA 干扰的应用前景 16 1.5 研究目的与意义 16 1.6 研究内容 17 2 材料与方法 18 2.1 实验材料 18 2.1.1 实验菌株 18 2.1.2 实验品种 18 2.1.3 载体与菌株 18 2.1.4 实验引物 18 2.1.5 实验试剂 19 2.1.6 培养基及试剂的配制 20 2.1.7 主要仪器设备 21 2.2 实验方法 22 2.2.1 基因敲除 22 2.2.1.1 菌株的活化 22 2.2.1.2 基因组DNA 的提取 22 2.2.1.3 用于Fg CNA 和FgCNB 基因敲除的线性DNA 片段的构建 23 2.2.1.4 PCR 产物纯化 24 2.2.1.5 胶回收 25 2.2.1.6 PEG 介导的原生质体转化 25 2.2.1.7 PCR 验证 26 2.2.2 基因沉默 27 2.2.2.1 沉默载体的构建 27 2.2.2.2 原生质体转化 32 2.2.3 荧光定量PCR 验证基因表达量 32 2.2.3.1 RNA 的提取 32 2.2.3.2 反转录 33 2.2.3.3 PCR 33 2.2.4 沉默菌株的表型测定 34 2.2.4.1 生长速度的测定 34 2.2.4.2 产孢能力的测定 34 2.2.4.3 孢子长度及隔膜数目的测定 34 2.2.4.4 耐盐胁迫 34 2.2.4.5 耐碱胁迫 34 2.2.4.6 产毒能力的测定 35 2.2.4.7 致病力的测定 35 2.2.5 应用实验 36 2.2.5.1 体外合成RNA 36 2.2.5.2 双链RNA 喷施抑制镰刀菌侵染试验 37 3 结果与分析 39 3.1 基因敲除 39 3.1.1 用于FgCNA 和FgCNB 基因敲除的线性DNA 片段的构建 39 3.1.2 基因敲除和PCR 验证 39 3.2 基因沉默 39 3.2.1 PCR 扩增目的基因片段验证 41 3.2.2 酶切与连接 42 3.2.3 反向片段的插入验证 43 3.3 PEG 介导的原生质体转化获得沉默转化子 44 3.