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生物技术实验 特点：微量操作，动作要精细；节奏缓慢，耗时长，要有耐心。 要求：课前预习，撰写预习报告；上课时遵守纪律，认真完成实验；课后认真撰写实验报告，并及时上交。 预习报告：应包括实验流程、注意事项及预期实验结果，老师抽查。 实验报告：包括实验题目（以老师提供为准）；实验目的；实验原理；主要的材料、试剂及仪器设备；实验步骤（以实际操作为准）；结果及分析（同组只需一份原始记录，如照片、膜等）。 实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 实验二 质粒DNA的提取及浓度测定 实验三 DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳 实验四 PCR扩增DNA特异性片段 实验五 原核细胞表达重组蛋白及其免疫鉴定 大肠杆菌感受态细胞的制备 和质粒DNA的转化 实验一 分组情况： 感受态制备：管 / 2人 / 小组 转化：3个培养皿 / 人 时间表：下午实验，第二天上午观察结果 一、实验目的 1．了解和掌握大肠杆菌感受态细胞制备的原理和基本操作方法 2．了解和掌握质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法 1．感受态细胞的制备 感受态细胞概念： 细胞的选择：E coli（R-，M-），如DH5α，JM109，HB101 制备方法： CaCl2处理；其他试剂（MgCl2（MgSO4）MnCl2、KCl） 影响因素：菌体状态（对数生长末期OD＝0.6，通气）、温度、器皿洁净程度、试剂质量、储存温度及时间、抗冻剂（甘油、DMSO）、速冻 二、实验原理 2．转化 转化的概念： 两类基本方法：热激；电击 热激转化法原理： 细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA与Ca离子形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经热激处理后，菌体细胞膜通透性发生改变，从而吸收DNA复合物。 3．筛选 抗生素筛选： Amp： 含β-内酰胺环的一类抗生素，是β-内酰胺酶抑制剂，抑制细胞壁合成。需过滤除菌。 Ampr：编码β-内酰胺酶，可分泌进入细菌外周质腔中，催化β-内酰胺环水解，从而解除毒性。 蓝白斑筛选： Ampicillin 结构式 pBS图谱 三、实验材料、仪器设备及试剂 1．实验材料 大肠杆菌DH5α菌株、pBS质粒（Amp r） 2．仪器设备 3．试剂及溶液 LB培养基、氨苄青霉素、CaCl2 四、实验步骤 1．大肠杆菌感受态细胞的制备： 2．细胞的转化： 3．结果观察： 注意观察完结果，4℃保存平板，供后续实验使用。 25 ml 菌液，离心收集菌体 12.5 ml CaCl2洗涤，离心收集菌体 1 ml CaCl2悬浮 ↓ ↓ ↓ 100μl 菌体＋2 μl 质粒 100μl 菌体＋2 μl 灭菌水 100 μl 涂平板（含Amp） 100 μl 涂平板（含Amp） 5 μl ＋995 μl 灭菌水， 取100 μl 涂平板（不含Amp） 热激＋1 ml LB 热激＋1 ml LB 转化子总数＝菌落数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化率（转化子数／μg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（μg） 需强调的： 注意无菌操作 观察完结果，4℃保存平板，供后续实验使用。 五、注意事项 1．所收集菌液的OD600值不能过大，因此在震荡培养时应注意观察细菌的生长状况。 2．整个实验过程应在冰浴环境下进行。 3．热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要。 4．由对照实验排除假阳性。 5 ．菌体及培养皿暴露时，注意无菌操作。 六、思考题  1．制备感受态细胞的原理是什么？ 2．如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？ 3、影响转化效率的因素有那些？