演示版酶类药物的分析.pptVIP

* 方法: * * 3、尿激酶（Urokinase） 由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶。 主要作用是激活人体内纤维蛋白溶酶原使其成为有活性的纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。 天然尿激酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶。 * * 效价测定原理(气泡上升法) 尿激酶激活人体内纤维蛋白溶酶原使其转化成纤维蛋白溶酶； 纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。 在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。 * * 操作(气泡上升法) 试管中加纤维蛋白原溶液0.3ml（37℃水浴） 标准品(或供试品) 1.0ml 加混合溶液0.4ml 立即摇匀计时，反应系统应在30～45秒内凝结，当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点。 以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。 * * 二、脂键水解酶－ 胰脂肪酶(Pancreatic Lipase ) 胰脂肪酶是一种水解酶，在一定条件下把甘油三脂类脂肪水解，最后生成甘油及脂肪酸。 底物:橄榄油 用已知浓度的标准碱溶液滴定，可定量地测定脂肪酸的量，从而得知脂肪酶活力。 * * 测定 * * 计算 每分钟水解橄榄油产生1μmol脂肪酸的酶量，为1个活力单位。 每克含有的胰脂肪酶单位 A:供试品消耗NaOH （0.1mol/L）的体积 B:空白消耗NaOH （0.1mol/L）的体积 W:供试品取样量（g） N:供试品稀释倍数。 * * 底物浓度对酶反应速度的影响 [S]/Km V/Vmax 0.01 0.99％ 0.1 1.0％ 1 50％ 10 91％ 100 99％ * * pH 酶活力测定选用缓冲体系。 不同缓冲液所受影响不同。磷酸盐所受影响较小，而Tris则受影响较大。 酶溶液用量与底物溶液比例不超过10％为宜。 * * 温度 温度变化1 ℃，反应速度可能相差10％以上，控制在± 0.1 ℃。 反应温度一般为25 ℃，此时酶不易灭活，Km较小，可以使用较低的底物浓度。 有些酶在37 ℃不稳定。 * * 酶浓度 酶样要充分稀释。 取3个不同酶量测得的产物量和酶浓度之间为正比关系，这样的酶浓度范围就是适当的。 * * 空白和对照 空白：指杂质反应或自发反应引起的变化量，代表未知因素的影响。 分为完全空白（如测定时要终止反应，则空白可先加终止反应试剂再加酶）。 酶空白 底物空白 * * 二、底物与产物的测定方法 （酶反应的检测方法） 1、化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。 2、分光光度法： 常用的有比色法和紫外分光光度法。 3、荧光测定法： 简单、灵敏、快速。 4、电化学分析法 （1）??? 离子选择性电极分析法 （2）??? 微电流法 5、其他方法 如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。 * ? 酶活力测定反应的检测方法 按照酶法分析方法测定酶活性时，需要跟踪酶促反应中某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量（速度法），或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化量（终点法）。可针对某些易于测定的酶促反应底物或产物选择具体的检测方法，包括容量分析法、气体检测法、光学检测法、黏度测定法、酶联免疫法等。 ? 分光光度法 若酶促反应中，反应底物或产物之一由于化学结构的改变，其吸光度的强度发生变化，可以通过测定该酶促反应系统的光吸收度的变化量，推算出酶的活力。多数酶类药物的含量检测（效价测定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、门冬酰胺酶、溶菌酶等。 * * 三、测定条件的选择 1、单因素选择 2、正交设计——多因素选择 * * 1、单因素选择－比色法测溶菌酶活性 以染料艳红K-2BP标记的M·Lysodeikticus为底物，分解后产生游离染色碎片（产物） 离心除去未分解底物，上清液比色 吸收度为溶菌酶活力的函数。 * * 测定条件选择－S pH （1）酶反应底物浓度曲线 以染料标记的M·Lysodeikticus为底物，酶量为20μg时，1%底物浓度已接近使酶饱和。 （2）酶反应PH曲线 磷酸缓冲液和柠檬酸—磷酸缓冲液。 不同组分的缓冲液，其最适PH稍有不同，选用pH6.5磷酸缓冲液。 * * 测定条件选择－离子强度 、反应时间及[E] （3）离子强度对酶反应的影响 离子强度在0.3mol/L以上为宜，选用0.5mol/L。 （4）酶反应过程曲线(反应时间)和酶浓度曲线 酶量为20 μg时，反应在30分钟以内，吸收度与反应时间有良好的线性关系，测定系统选用15分钟。 酶量在50μg之内，吸收