考点加强课5 基因表达载体构建中限制酶的选择原则.pdfVIP

限制酶选择的三大依据 1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 图1 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图甲可选 择Pst Ⅰ(目的基因两端均具Pst Ⅰ)。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,以防破坏目的基因,如图甲不能选择 Sma Ⅰ。 (2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接 ,也可使用不同的限制酶切割目 的基因和质粒,如图甲也可选择用 Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也 有这两种酶的切点),而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。 2.根据质粒的特点确定限制酶的种类 (1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保具有相同的黏性末端。 (2)质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结 构,应至少含有一个完好的标记基因,如图2 中限制酶pst Ⅰ因其会破坏该质粒上唯 一的标记基因而不宜选择。 (3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2 中Kpn Ⅰ)。如 果所选酶的切点不止一个,则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段 含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 (4)所选限制酶,其切点应位于启动子与终止子之间,如图