免疫组织化学及HE染色实验步骤.docVIP

免疫组织化学（? immunohistochemistry） 1组织脱水、包埋及切片 （1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月； （2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇?浸泡30min—95%乙醇??浸泡30min—无水乙醇?浸泡30min—无水乙醇??浸泡30min—无水乙醇???浸泡30min—二甲苯?浸泡30min—二甲苯??浸泡30min； （3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜； （4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块； （5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5μm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。 2免疫组化染色 （1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯?浸泡10min—二甲苯??浸泡10min—无水乙醇?浸泡5min—无水乙醇??浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min； （2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min； （3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min； （4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h； （5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜； （6）将组织切片从冰箱中取出，放于室温静置至室温，用PBS摇床清洗3次，每次10min，用5%山羊血清稀释生物素标记的二抗覆盖组织表面，室温孵育45min，PBS摇床洗3次，每次10min； （7）组织表面滴加适量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min； （8）DAB显色：配制DAB显色液，滴加至组织表面，在显微镜下观察着色，待出现明显棕色且背景无明显着色时放于自来水中终止显色； （9）苏木素染核1-2min，用自来水冲洗终止染色； （10）将组织依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇?、无水乙醇??各5min，再放入二甲苯? 10min，二甲苯?? 10min，完成组织脱水和透明； 滴加一滴中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。 3 H-E染色 （1）在完成脱蜡复水的切片上，滴加适量苏木素使其覆盖组织表面，染核5min，自来水冲洗掉残余的染液； （2）快速用1%盐酸酒精分化，用自来水冲洗； （3）滴加适量伊红染液于组织表面，染色30s，自来水冲洗； （4）同3.10.2免疫组化染色中（10）的步骤相同对组织进行脱水透明后，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。