免疫共沉淀步骤-磁珠.docVIP

一、细胞裂解 1、转染后24-48 h收获细胞，用冷的PBS（4°C）洗细胞三次，最后一次吸干PBS； 2、加入适量（500μl）预冷的细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min； 3、用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下，将裂解液收集到1.5mlEP管中，4°C、最大转速（14000rpm）离心30 min后取上清； 4、取少量（20μl）裂解液以备western blotting分析； 二、准备磁珠 5、将Dynabeads完全重悬； 6、吸取50μl（1.5mg）Dynabeads到一个EP管中；（准备两份，一份结合抗体，一份去除非特异性蛋白） 7、将EP管放在磁力架上，将Dynabeads从溶液中分离出来，吸去上清； 8、再用预冷的lysis buffer 500μl洗三次，每次都用磁力架将Dynabeads分离出来，最后将EP管从磁力架上取下来； 三、结合抗体 9、取10μl的Antibody（Ab），加入到准备好Dynabeads的EP管中； 10、4°C旋转、孵育5h； 11、将EP管放在磁力架上，把Dynabeads-Ab复合物从溶液中分离出来，吸去上清； 12、用冷的lysis buffer 1000μl洗三次，最后一次尽量吸尽上清，再加入25μl的lysis buffer和0.2μl的10%叠氮化钠； 四、免疫共沉淀 13、在裂解好的细胞样品500μl（步骤3）中加入Dynabeads（步骤6）25μl中，4°C旋转2h（去除非特异性蛋白）； 14、将EP管放在磁力架上，收集上清； 15、将上清加入预处理的Dynabeads-Ab复合物中，轻轻重悬Dynabeads-Abs复合物； 16、4°C旋转、孵育2h，让Ag与Dynabeads-Abs复合物结合； 17、将EP管置于磁力架上，转移上清到一个新的EP管中，以备需要时进一步分析； 18、用1000μl的lysis buffer洗Dynabeads-Ab-Ag复合物三次，每次清洗后在磁力架上分离，移去上清，再温柔地重悬复合物；（Avoid co-elution of proteins bound to the tube wall） 四、洗脱目标蛋白 19、将EP管放在磁力架上，吸去上清； 20、加入20μl的2×SDS 上样缓冲液，轻轻重悬Dynabeads-Ab-Ag复合物； 21、50°C加热10min； 22、将EP管放在磁力架上，取上清作为样品，SDS电泳。