实验四PCR产物T载体克隆和转化.ppt

志比昆合 青海大学医学硕士研究生课程 学竟江河 医用分子生物学 实验技术 青海大学 Qinghai University  志比昆合 学竟江河 重组DNA技术操作步骤 青海大学 Qinghai University  志比昆合 学竟江河 基本原理 目的基因的获取→克隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接→DNA导入受体细胞 →重组体的筛选→克隆基因的表达 青海大学 Qinghai University  志比昆合 学竟似河 主要步骤: ①制备目的基因和选择相关载体 ②目的基因和有关载体进行连接 ③重组的DNA导入受体细胞 ④DNA重组体的筛选和鉴定 ③DNA重组体的扩增、表达和其他研究 青海大学 Qinghai University  ◎+ 载体外源 重组DNA分子 DNA 以质粒为载体的N克隆过程 转化或转染 细菌 殖 889 重组DNA增 D A 细菌在培养液 中紧殖后在固 体培养基生长 筛选含重组 质粒的细菌  志比昆合 学竟似河 、目的基因的获得—分 (一)从基因组文库中获得 (二)从cDNA文库中获得 (三)PCR扩增特定基因 (四)人工合成 青海大学 Qinghai University  从基因组DNA文 组织或细胞染色体DNA 库获取目的基因 限制性内切酶 基因片断 基因组DNA文库 克隆载体 存在于转化细胞内重组DNA分子 由克隆载体所携带的所 受体菌 有基因组DNA的集合 含重组分子的转化菌  限制酶切位点 真核生物染 Rcos 色体DNA Ww 限制酶消化 限制酶部分消化 除去中间片段 CoS 左臂 ~20 kb dna片段 外源DNA与载体DNA混合 ~20Kb外源DNA coS 连接反应 休外包装 黑黑黑黑 用重组噬菌K9。°° 感染大肠杆菌 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库  从cDNA文库获取目的基因 AAAA mRNA 反转录酶 逆转录酶 二二AAA CDNA TTTT 复制 碱水解 双链cDNA TTTT 一载体 DNA聚合酶 重组DNA分子 受体菌 SI核酸酶 cDNA文库  化学合成法获取目的基因 氨基酸 trp phe met lys ACCAAGTACITTT ACCAAAITACITTT 可能的DNA序列 ACCAAGTACITTC ACCAAATACITTC 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。