多克隆体制备.ppt

多克隆抗体的制备及 抗体活性测定 张江中试平合 陈伟伟  主要内容 ●多克隆抗体制备的基本原理 多克隆抗体制备的操作步骤 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断  原理 1、克隆( clone):是指无性繁殖细胞系,由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中, 如无发生突变其基因是完全相同的 2、多克隆抗体( polyclonal antibody,pAb):用一种包含多 种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺激机体多个B细胞克 隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清 实际上是含有多种抗体的混合物,即多克隆抗体。 3、单克隆抗体( monoclonal antibodies,mAb):由一个 识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均 、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。  抗体牧展历史 ●第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物 后获得抗体,称为多克隆抗体( polyclonal antibody 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗 原决定簇的抗体称为单克隆抗体( monoclonal antibody, McAb) ●第三代抗体是利用基因工程技术制备而来,称为基因工 程抗体( genetic engineering antibody)。  多克隆抗体制鲁流程 免疫原的制备 ●免疫动物 ●免疫血清的收集 免疫血清的鉴定 免疫血清的保存  免疫原的制备 免疫原( Immunogen) 指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 的抗原最重要的性质是免疫原性( Immunogenicity) 免疫原种类: 天然抗原、人工合成抗原 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。  细胞性抗原制备 绵羊红细胞(SRBC)-溶血素 细菌-抗菌抗体(动物免疫血清)。 可溶性抗原制备: 指蛋白质、多糖和脂类等。  细胞破碎 反复冻融法 ●超声破碎法 ●自溶法 酶处理法 表面活性剂处理法  粗分高 超速离心分离: 是一种根据分离物质的比重特点,通过差速或梯度密 度离心,将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法,只 适宜少数大分子物质的分离。 选择性沉淀 选择某抗原理化特性,采用相应沉淀剂或溶液环境, 如 核酸去除 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白 8%~12%E66000可沉淀IgG  超滤法 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原 物质进行滤筛。 电泳