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第二章分子克隆常用工具酶 HHHDOOO ZXXABOOX Restriction Enzyme 田振东 Tianzhd@mail.hzau.edu.cn TelOffice:园林楼620  DNA的基本结构 Structure and features 每一单链具有5-3极性 double stranded DNA 两条单链间以氢键连接 两条单链,极性相反,反向平行c 以中心为轴,向右盘旋 Deoxy-AIP 3 deoxyribose 植物基因工程  Backbone Heating Renaturation] Double strand Single strands BDNA  Replica DNA primase(LEF1/LEF2 NA ligase( Host ?)RNA primer E1? DNA polymerase stra OKiILIC Leadin strand Topoisomerase DNA polymerase Host ? helicase single strand DNA binding protein (LEF-3)  分子克隆操作过程 克隆目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割 和连接,制成重组DNA→导入宿主细胞→筛选、鉴定 →扩增和表达。 基因工程的操作过程 88目 88 植物基因工程  工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、 聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。 要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来, 需要各种限制性核酸内切酶( restriction endonuclease);要把不同片段连接起来,需要DNA 连接酶( ligase);要合成基因或其中的一个片段,需 要DNA聚合酶( polymerase)等 因此,酶是DNA重组技术中必不可少的工具。 植物基因工程  核酸内切酶 核酸水解酶类核酸外切酶 DNA聚合酶 核酸合成酶类RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核酸修饰酶类核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶 植物基因工程  用于核酸操作的常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶  常用的工具酶性质及功能 工具酶名称 主要功能 限制性内切核酸酶 在DNA分子内部的特异性的硪基序列内部进行切割 DNA连接酶 将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整 DNA聚合酶 通过向3·端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口,即 DNA poly merase I 5-3DNA聚合酶活性与3-5及5+3外切酶活性 多核苷酸激酶 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5-OH末端上 DNA polymerase kinease 转录酶 以RNA分子为模板合成互补的cDNA链 Reverse transcriptase DNA末端转移酶 将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3′-OH末端或DNA的3∵末 DNA terminal transferase端标记dNTP 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸,同时也 nuclease SI 可切割双链核酸分子的单链 Taq dNA聚合酶 能在高温(72℃)下的单链DNA为模板,从5→3方向合成新生的互补 Taq DNA polymerase 植物基因工程  第一节分子克隆最常用两个工具酶 “分子 1.限制性核酸内切酶——在DNA上核苷酸的 剪刀” 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如 ECoRI, Hpai 分子胶”2DN连接酶 促使具有互补粘性末端或平 头末端的载体和供体DNA片段连接,形成重组DNA分 子 植物基因工程