超声调控血小板生物活性与装载纳米颗粒的研究.pdf

摘要 摘要 血小板作为循环系统的哨兵，其在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及 器官移植排斥等生理和病理过程中发挥了重要作用。近年来，开发靶向血小板以 及利用天然血小板自身或血小板膜构建的各种微纳药物输运系统已在血栓和肿 瘤等疾病诊治方面显示了极大的潜力。本论文以血小板为研究对象，深入探究了 超声能量对血小板生物活性的影响，并进一步通过超声能量的调控，实现了血小 板细胞膜渗透性增强后的小分子成分和纳米颗粒的细胞内装载，无损装载了纳米 颗粒的血小板既保持了天然血小板的生物活性和功能，又可进一步应用于暗场、 光声的生物成像研究。该论文主要研究内容如下： 首先，研究了超声能量（超声频率、强度和作用时间）对血小板生物活性的 影响。从血小板的聚集能力、P 选择素（CD62P ）在血小板膜上的表达量等方面 探究了血小板对超声能量的响应，结果表明，低频超声（45 kHz, 80 kHz, 100 kHz ） 对血小板的聚集功能基本没有影响；当超声频率为 1 MHz 时，0.25 W/cm2 的超 声强度对血小板的聚集功能、表面形态以及微粒释放均没有太大的影响，但当超 声强度大于 0.25 W/cm2 时，除会影响血小板的聚集能力，还会使血小板产生伪 足、改变血小板的形态、增加血小板的微粒释放，并且随着超声强度的增加而加 剧；当超声强度为 0.25 W/cm2 时，超声时间 60 s 对血小板的生物活性不会产生 影响，但当超声时间大于 60 s 时，对血小板的聚集能力、表面形态及微粒的释放 会产生影响，却不会影响血小板的 α 颗粒分泌 CD62P ，并且超声参数为 1 MHz， 2 0.25 W/cm ，60 s 时，血小板的蛋白成分亦不受影响。 2 进而，在优化超声能量参数条件下（1 MHz, 0.25 W/cm , 60 s ），研究了超声 能量促进氯金酸、还原剂（NaBH4 和柠檬酸钠）等小分子物质进入血小板，进一 步利用血小板内还原酶，在细胞内原位合成金纳米颗粒（GNPs ）。结果表明，血 小板的细胞膜在超声能量作用下渗透性增强，细胞质中能快速（30 min ）原位合 成 5 nm 左右的 GNPs 。血小板细胞质内均匀分布的GNPs （Au 合成量为（12.7 ± -3 2.4 ）× 10 pg/细胞）使血小板具有拉曼增强效应，并可实现血小板的暗场成像和 计算机断层扫描(CT)成像。 最后，进一步通过超声能量的调控，研究了 GNPs 与血小板的相互作用过程， 2 结果表明，在超声能量为 0.25 W/cm (1 MHz, 60 s)时，36 nm 的GNPs 通过胞吞 作用/开放性小管系统（OCS ）的细胞膜内化及声孔效应机理，能够被快速（30 min ）装载进入血小板内。与传统的共孵育装载 GNPs 的方法相比，装载量提高 了32.1 ％。装载GNPs 后的血小板具有光声和暗场成像的效果。此外，研究发现， 表面包裹聚葡萄糖山梨醇羧甲基醚的 γ-纳米氧化铁不能被装载进入血小板内，表 明纳米颗粒的不同表面修饰会影响装载过程。 I 东南大学硕士学位论文 本论文提出的超声辅助下在血小板内原位合成以及直接装载 GNPs 的方法， 在血小板保持天然活性和生物学功能的基础上，实现了纳米颗粒的装载，这种声 能协助构建的“特洛伊木马”仿生多功能载体，可实现天然高靶向、多模式生物 成像等应用研究，在血小板相关疾病的诊断和治疗中具有极大的应用潜力。 关键词：血小板，纳米颗粒，超声，光声成像，暗场成像 II