实验大肠杆菌感的受态细胞制备及转化.pptVIP

实验 大肠杆菌感受态细胞的 制备及转化 内容一:大肠杆菌感受态细胞的制金 实验目的 实验原理 实验仪器、材料、试剂 实验步骤 注意事项 思考题 实验目的 ◇掌握感受态细胞的概念及其意义。 ◇掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。 实验原理 感受态:受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并 实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所 决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响 制备感受态的细胞一般选择对数生长期,新鲜幼嫩的 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。常用的感 受态制备方法包括KC、CaCl等方法;后者因为操作简便 且符合大多数的分子克隆要求,因而被广泛采用。 实验原理 CaCl2法的基本原理: 细菌处于低温(0℃)和低渗的CaCl2溶液 中,菌体膨胀,细胞膜的通透性发生了暂时性 的改变,转化混合物中的DNA形成抗 DNase的 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面,在42℃ 进行短时间的热激处理,促进DNA的吸收 实验原理 CaCl2法简便易行,用CaC2法制备的 感受态细胞,可使每微克超螺旋质粒DNA 产生5×106-2×107个转化菌落。在实际工作 中,每微克有105以上的转化菌落足以满足 般的克隆实验。 制备出的感受态细胞暂时不用时,加入 占总体积15%的无菌甘油于-70℃,可以保 存半年 实验原理 提高转化效率要考虑几个重要因素: 1、细胞生长状